用Calreticulin-Like蛋白治疗血管瘤的研究

论文摘要

血管瘤是毛细血管的异常增生,是儿童的常见病和多发病。当前,在治疗血管瘤上没有特效的药物。血管生成抑制因子是特异抑制血管内皮细胞增殖的蛋白质。本论文研究用Careticulin-like蛋白治疗血管瘤。应用套叠PCR合成careticulin-like序列,构建含careticulin-like基因的毕赤酵母表达载体pPIC9K-careticulin-like,通过电转法将表达载体转化毕赤酵母基因组,通过G418抗性筛选高基因拷贝重组子,获得工程菌GS115（pPIC9K-careticulin-like）。在发酵罐中进行高密度发酵GS115（pPIC9K-careticulin-like）表达重组蛋白。用离子交换法纯化重组Careticulin-like蛋白。纯化的目标蛋白具有抑制CAM血管生成的活性。Careticulin-like蛋白诱发血管瘤细胞凋亡,其主要表现是细胞固缩。公鸡的肉垂是天然的血管瘤模型。本研究以60日龄公鸡的肉垂为血管瘤模型,进行用Careticulin-like蛋白治疗血管瘤试验。在试验组右侧肉垂每天注射Careticulin-like蛋白20μ g,对照组左侧肉垂每天注射等体积的PBS。在用药14天后,治疗组的肉垂长度为平均1.90cm,对照组的肉垂长度为平均2.52cm,呈显著性差异（P<0.001）；试验组用药侧肉垂平均血管数量为个/100个视野,对照组的血管数量是为个/100个视野,两组之间的血管数量呈显著性差异（P<0.001）；对照组的用药部位组织细胞正常,而由于缺少血管供给营养的试验组,其用药局部出现明显组织凋亡。实验组鸡的体重平均增长275g/只,对照组鸡的体重平均增长325g/只,两组之间体重的变化没有显著性差异（0.1<P<0.25）。以上结果表明Careticulin-like蛋白能有效地抑制血管瘤细胞的增殖,有效地抑制血管瘤模型的血管的增殖和抑制血管瘤的发展。具有开发为治疗血管瘤药物的前景。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 文献综述
• 前言
• 1.1 血管瘤的研究进展
• 1.1.1 血管瘤的分类
• 1.1.2 血管瘤发病机制及危害
• 1.1.3 目前主要的血管瘤治疗方法及优缺点
• 1.1.4 以鸡冠为模型的血管瘤动物研究
• 1.2 血管生成抑制素的研究
• 1.2.1 管生成抑制因子
• 1.2.2 钙网蛋白
• 1.3 巴斯德毕赤酵母表达系统
• 1.3.1 巴斯德毕赤酵母表达系统的特点
• 1.3.2 发酵产物的影响因素
• 1.3.3 表达系统的缺陷及解决办法
• 1.4 本研究的意义、内容以及技术路线
• 1.4.1 本研究的意义
• 1.4.2 本研究的内容
• 1.4.3 技术路线
• 第2章 CL基因的合成与表达载体的构建
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.1.1 质粒及菌株
• 2.1.1.2 分子生物学常用酶和试剂（盒）
• 2.1.1.3 主要仪器设备
• 2.1.1.4 主要试剂、培养基和缓冲液
• 2.1.2 实验方法
• 2.1.2.1 CL基因的合成
• 2.1.2.2 质粒的提取
• 2.1.2.3 CL基因和载体的双酶切
• 2.1.2.4 酶切产物的回收
• 2.1.2.5 目的基因与载体的连接与转化
• 2.1.2.6 重组子的鉴定
• 2.1.2.7 酵母重组表达载体的构建
• 2.1.2.8 酵母重组表达载体的鉴定
• 2.2 实验结果
• 2.2.1 CL基因的合成
• 2.2.2 PPIC9K-CL重组表达载体的构建
• 2.2.3 PPIC9K-CL重组表达载体双酶切鉴定
• 2.2.4 PPIC9K-CL重组表达载体的测序分析
• 2.2.5 酵母重组表达载体的构建
• 2.2.6 酵母重组表达载体高拷贝转化子的筛选
• 2.3 本章小结
• 第3章 CL蛋白的表达、纯化及活性分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.1.1 菌株
• 3.1.1.2 主要仪器设备
• 3.1.1.3 主要试剂、培养基
• 3.1.1.4 蛋白电泳主要试剂
• 3.1.1.5 蛋白纯化主要试剂
• 3.1.1.6 蛋白活性分析主要试剂
• 3.1.2 实验方法
• 3.1.2.1 重组酵母工程菌的摇瓶表达
• 3.1.2.2 表达产物的初步纯化及SDS-PAGE电泳
• 3.1.2.3 初步纯化产物的SDS-PAGE电泳
• 3.1.2.4 重组酵母工程菌的高密度发酵表达
• 3.1.2.5 重组目的蛋白的纯化
• 3.1.2.6 纯化后的目的蛋白的透析处理
• 3.1.2.7 重组蛋白对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成抑制活性的测定
• 3.1.2.8 重组蛋白对细胞用药实验
• 3.1.2.9 细胞凋亡检测
• 3.1.2.10 重组蛋白对鸡冠血管生成抑制活性的测定
• 3.2 实验结果
• 3.2.1 重组酵母工程菌的摇瓶表达
• 3.2.2 表达蛋白纯化及透析处理
• 3.2.3 重组蛋白对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成抑制活性的测定
• 3.2.4 重组酵母工程菌的高密度发酵
• 3.2.5 重组蛋白对细胞用药实验
• 3.2.6 重组蛋白对鸡冠血管生成抑制活性的测定
• 3.3 本章小结
• 第4章 讨论及结论
• 4.1 讨论
• 4.1.1 Calreticulin-Like蛋白的开发前景
• 4.1.2 表达体系的选择
• 4.1.3 本研究中值得改进的部分和研究的下一步研究方向
• 4.2 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢