葛根素注射液溶血毒性机制研究

论文摘要

我国是中医药的发源地,中医药文化源远流长。中药注射剂是中药制剂的新剂型,相对其他中药剂型,它不仅保留了中药的特性,而且兼具有西药药效快、使用方便、生物利用率高、剂量更为准确、疗效确切等特点。从而得到快速发展。根据WHO（World Health Organization）对于药物不良反应的统计资料表明:近几年来,药物不良反应发生率一般为520%,住院病人约有1041.5%发生药物不良反应。药物作为防治疾病、调节人体生理机能的特殊物质,虽然在上市前已做过非临床安全性评价、临床试验,但由于非临床前研究的局限性和上市前临床研究的局限性,一些发生频率低于1%的不良反应和一些需要较长时间应用才能发生及迟发性的不良反应未能发现,加上药物不良反应的发现存在滞后现象特点,因此对药物上市后再评价更显其重要性和必要性。葛根素系从豆科植物野葛或甘葛藤根中提出的一种黄酮苷,是葛根素注射剂主要成分。作为血管扩张药,有扩张冠状动脉和脑血管、降低心肌耗氧量,改善微循环和抗血小板聚集的作用。由于葛根素与其他治疗心脑血管疾病的药物相比具有疗效好、价格低的优势。因而,临床应用非常广泛。在全国样本医院心脑血管疾病用药销售额排序前10位的药品中,葛根素排列第三,2003年总销售量已达20亿元人民币以上。但是,随着葛根素的广泛应用,有关其不良反应的报道逐渐增多,而急性血管内溶血是葛根素注射剂最严重的不良反应。因此,葛根素注射液致血管内溶血成为其使用的巨大障碍,尽管在2003年1月至2006年,国家药品不良反应中心对其急性血管内溶血进行多次通报和SFDA多次发布葛根素管理和使用措施通知,但其血管内溶血机制仍不十分清楚。鉴于葛根素注射液致急性血管内溶血的严重性,本课题根据《中药注射液安全性再评价基本技术要求》和葛根素注射液临床不良反应特征,选择急性毒性试验和例外溶血试验进行安全性再评价,进而在此基础上,通过体外试验的红细胞毒理学深入探讨了葛根素致红细胞溶血反应发生的机制。开展葛根素注射液毒性机制研究,不仅有较大的应用价值和学术价值,而且为葛根素进一步结构改造,降低毒性及不良反应提供依据,有助于减少葛根素临床使用中的风险,确保患者的用药安全。急性毒性试验采用Bliss法测定LD50及其它相关参数。300-600mg·kg-1之间分为5个剂量组,单次尾静脉注射,15 mg·mL-1给药容积。结果:死亡动物,表现为俯卧、低伏、运动失调、震颤、强直性抽搐、惊跳反射、痉挛等症状,最终死亡,死亡时间均在注射后即刻至3 min内;未死亡动物,上述症状逐渐减弱,约20 min后基本恢复正常。所有试验小鼠大体解剖未见明显异常,未发现特异性靶器官。经计算雄性、雌性小鼠LD50分别为:415.2（374.4460.4）、439.2 （371.6519.1）mg·kg-1;溶媒丙二醇组,试验小鼠全部存活;减小给药容积至10 mg·mL-1,中毒症状及死亡未明显改变,雄性、雌性LD50为: 466.8（417.6521.9） mg·kg-1、450.4（409.7-495.1） mg·kg-1;分别使用0.9% NaCl注射液和5%葡萄糖注射液稀释葛根素浓度于0.440 mg·mL-1之间,pH值均小于4.0。结果提示:葛根素注射液急性毒性时动物死亡原因与过敏反应、溶血反应、动物性别、给药容积和临床使用溶剂无关,溶剂丙二醇对葛根素注射液急性毒性无影响,给药速度和溶液pH对葛根素注射液急性毒性有影响。体外溶血试验依据《中药、天然药物局部刺激性和溶血性试验研究技术指导原则》,考察不同浓度葛根素注射液和丙二醇对不同红细胞溶血率和凝集性。用0.9% NaCl注射液将葛根素注射液稀释为浓度0.5、1、2、4、8和16 mg·mL-1,与新鲜的2%红细胞悬液混匀后置于37℃温育6 h后,OD490测吸光度值,计算红细胞溶血率和观察凝聚反应。结果葛根素对比格犬、人及家兔红细胞体外溶血的半数溶血浓度分别为:2.79、3.96和5.47 mg·mL-1;引起三种红细胞最大溶血率时葛根素浓度分别为:65.36、81.89和135.06 mg·mL-1;三种红细胞毒-效反应关系的斜率分别为:1.45、1.96和0.49。大剂量葛根素可使三种红细胞产生假凝集现象,而丙二醇则无此现象。结果显示:一定剂量的葛根素注射液使三种红细胞均产生明显溶血,溶血率与葛根素剂量呈正相关;值得注意的是:人红细胞剂量-效应反应曲线的斜率最大,说明一旦达到能够引起溶血的浓度,会很快达到最大溶血率,提示:在一些疾病状态下,以及输液速度快等情况时,易发生急性血管内严重溶血;溶剂丙二醇在使用浓度下,对葛根素注射液溶血性无影响;鉴于葛根素引起的不同种属红细胞溶血均具有剂量-效应关系,及不引起红细胞凝集,提示:葛根素所引起的急性溶血为药源性非免疫性溶血。从生理、生化角度出发,考察溶血源葛根素对红细胞渗透脆性、红细胞膜氧化性、红细胞形态、ATP能量代谢等的影响。结果发现:高剂量葛根素,红细胞开始溶血及完全溶血时NaCl浓度差大于0.08%,而丙二醇高剂量组空白对照组的红细胞开始溶血及完全溶血时NaCl浓度与组无差异,大剂量葛根素可使红细胞膜渗透脆性增强;葛根素注射液及丙二醇随剂量与红细胞膜荧光偏振度和微粘度呈负相关,流动性正相关,而葛根素注射液组与丙二醇组比较,红细胞膜荧光偏振度和微粘度小;低剂量葛根素注射液组,大鼠红细胞SOD、GSH-Px活性升高,高剂量葛根素组,大鼠红细胞SOD、GSH-Px活性降低。而丙二醇组,随剂量增加,SOD、GSH-Px活性增加。低剂量时,葛根素注射液和丙二醇组均使MDA升高,随二者剂量增加,MDA含量均减少;丙二醇组SA含量低于相应葛根素注射液组,且二者SA含量均低于空白对照组;葛根素注射液组红细胞膜表面Na+-K+-ATPase的活性升高;高剂量组红细胞膜表面Ca2+-Mg2+-ATPase活性降低,低剂量组Ca2+-Mg2+-ATPase活性降低升高;随剂量增加,不规则形状红细胞数量增加,并且聚集,粘连逐渐增加。而丙二醇（10%）组红细胞形态未发现明显异常;高浓度葛根素注射液与红细胞作用后,同样可使骨架蛋白表达的减少及部分蛋白条带的表达异常增加。综合上述研究结果,我们认为:溶剂丙二醇、给药容积和动物性别对葛根素注射液急性毒性无影响;而溶液pH值和给药速度可能对葛根素注射液急性毒性产生影响;葛根素注射液在体外能够引起药源性非免疫性溶血;溶剂丙二醇对葛根素注射液溶血无影响;机体在病理状态或快速给药时,可能容易诱发急性血管内溶血等不良反应的产生;葛根素可与红细胞膜蛋白或膜相互作用,改变膜结构和状态,增加红细胞膜在低渗溶液中的渗透脆性,增加膜流动性,通过抑制SOD、GSH-Px、Ca2+-Mg2+-ATPase活性和干扰SA、MDA代谢,引起膜蛋白尤其是骨架蛋白的缺失或降解,等多个途径导致溶血发生。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一章 葛根素注射液一般毒理学研究
• 第一节 葛根素注射液急性毒性试验
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二节 葛根素注射液体外溶血性比较
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第二章 葛根素注射液溶血毒性机制研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 全文总结
• 参考文献
• 综述
• 个人简介
• 致谢