食品中百草枯残留免疫学分析方法的研究与应用

论文摘要

百草枯（paraquat,PQ）是一种广谱、灭生性有机杂环类除草剂。由于百草枯的广泛应用,造成食品原料和水体污染,对人体健康产生潜在危害。目前百草枯检测方法大多需要专门的仪器设备并且操作繁琐,已无法满足现场快速检测的要求。因此,研究和建立一种方便、安全和快速的检测方法具有重要意义。本文以多克隆抗体和胶体金合成标记技术为基础,建立了百草枯的酶联免疫（ELISA）和金标免疫层析（GICA）检测方法,并将其应用于食品中的检测。首先以4,4’-联吡啶和碘甲烷为起始原料,经三步反应合成了百草枯半抗原N-甲基-N′-戊酸基-二吡啶二溴化物,经LC/MS、1HNMR和IR鉴定结果表明,所得产物即为百草枯半抗原（简称PQ-h）,其纯度为96%,得率为69%。通过混合酸酐法偶联大分子蛋白载体牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）制备免疫抗原（PQ-h-BSA）和包被抗原（PQ-h-OVA）,并进行结构鉴定。利用分光光度法测定百草枯半抗原与BSA的偶联比为6:1。通过免疫新西兰大白兔,获得特异性多克隆抗体,效价为51200。建立了PQ检测的间接竞争ELISA方法,经过多次棋盘试验,最终确立最适包被抗原浓度为0.3μg/mL,抗体最佳稀释度为1:5000。该方法的半数抑制率IC50为5.13 ng/mL,最低检出限为0.005 ng/mL。百草枯与敌草快的交叉反应率小于0.1%。大豆样品的加标回收率在70%80%之间,相对标准偏差（RSD）低于10%。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,通过研究胶体金与抗体蛋白作用过程,确定稳定标记1 ml胶体金需8.1μg抗体蛋白,标记体系的最佳pH为8.5。以金标抗体作为分析探针,PQ-h-OVA作为竞争抗原,以羊抗兔IgG为控制抗体,构建直接竞争胶体金标免疫层析检测体系。确定膜上包被抗原和羊抗兔二抗的最佳包被浓度分别为0.5 mg/ml和0.11 mg/ml。金标目测检出限为10 ng/ml,检测时间约5 min。方法的重复性和稳定性较好,经推测,该试纸条在室温下至少可以保存5个月。对大豆进行加标回收试验,回收率较好。本研究所建立的检测食品中PQ残留的间接ELISA法和GICA法,快速、方便,具有较好的实用价值,为ELISA检测试剂盒和金标试纸条检测食品中PQ的进一步研究提供了重要的实验依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 百草枯简介
• 1.2 百草枯的毒性及作用机理
• 1.2.1 百草枯的急性毒性
• 1.2.2 百草枯慢性毒性
• 1.2.3 百草枯在体内的吸收和代谢
• 1.2.4 百草枯的神经毒性
• 1.2.5 百草枯的中毒机制
• 1.2.6 百草枯在环境中的代谢途径
• 1.3 食品中百草枯的限量标准
• 1.4 百草枯的分析方法
• 1.4.1 活生物体分析法
• 1.4.2 仪器分析法
• 1.4.3 免疫化学分析法
• 1.4.4 不同分析方法的比较
• 1.5 胶体金免疫检测技术
• 1.5.1 胶体金免疫检测技术的原理和特点
• 1.5.2 胶体金免疫检测技术的分类和应用
• 1.6 本课题研究的意义及主要内容
• 第二章 百草枯人工抗原的制备及鉴定
• 2.1 引言
• 2.2 材料与仪器
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 主要仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 百草枯半抗原分子设计与合成
• 2.3.2 混合酸酐法合成百草枯人工抗原
• 2.3.3 百草枯半抗原衍生物的鉴定
• 2.3.4 百草枯人工抗原的鉴定
• 2.3.5 分光光度法测定免疫原的偶联比
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 百草枯完全抗原的构建原理
• 2.4.2 百草枯半抗原衍生物的鉴定
• 2.4.3 百草枯人工抗原的鉴定
• 2.4.4 人工抗原偶联比的测定
• 2.5 讨论
• 2.6 本章小结
• 第三章 抗百草枯抗体的制备及ELISA 方法的建立
• 3.1 引言
• 3.2 材料与仪器
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 主要仪器
• 3.2.3 主要溶液
• 3.3 试验方法
• 3.3.1 抗血清的制备
• 3.3.2 抗血清的纯化
• 3.3.3 纯化后抗体含量的测定
• 3.3.4 间接ELISA 法测定抗血清的效价
• 3.3.5 最佳包被抗原浓度及抗体稀释度的筛选
• 3.3.6 竞争ELISA 标准曲线的制作
• 50 的确定'>3.3.7 半数抑制浓度IC₅₀的确定
• 3.3.8 特异性的测定
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 纯化后抗体含量的测定结果
• 3.4.2 抗血清效价及工作浓度的确定
• 3.4.3 包被抗原及抗体稀释度的确定
• 3.4.4 竞争ELISA 标准曲线的制作
• 50 的确定'>3.4.5 半数抑制浓度IC₅₀的确定
• 3.4.6 特异性的测定
• 3.5 讨论
• 3.5.1 ELISA 方法的技术要点
• 3.5.2 ELISA 方法的评估
• 3.6 本章小结
• 第四章 百草枯金标免疫层析检测方法的建立
• 4.1 引言
• 4.2 材料与仪器
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 主要仪器
• 4.2.3 试纸条材料
• 4.3 主要溶液的配制
• 4.3.1 抗原稀释液
• 4.3.2 抗体稀释液
• 4.4 试验方法
• 4.4.1 胶体金的制备
• 4.4.2 胶体金的质量鉴定
• 4.4.3 胶体金标记抗体蛋白
• 4.4.4 硝酸纤维素膜的选择
• 4.4.5 NC 膜上包被抗原浓度的选择
• 4.4.6 NC 膜上羊抗兔IgG-HRP 包被浓度的选择
• 4.4.7 金标抗体浓度的选择
• 4.4.8 金标试纸条的组装及构建原理
• 4.4.9 金免疫层析试纸条的质量性能测试
• 4.5 结果与分析
• 4.5.1 胶体金的质量鉴定
• 4.5.2 胶体金标记抗体蛋白
• 4.5.3 硝酸纤维素膜的选择
• 4.5.4 NC 膜上包被抗原浓度的选择
• 4.5.5 NC 膜上羊抗兔二抗包被浓度的选择
• 4.5.6 金标抗体浓度的选择
• 4.5.7 金免疫层析试纸条的质量性能测试
• 4.6 讨论
• 4.6.1 胶体金的制备
• 4.6.2 胶体金标记蛋白
• 4.7 本章结论
• 第五章 免疫学分析法在食品检测中的初步应用
• 5.1 引言
• 5.2 材料与仪器
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.2 主要仪器
• 5.3 试验方法
• 5.3.1 免疫学检测方法的应用
• 5.3.2 HPLC 检测法的建立
• 5.4 结果与分析
• 5.4.1 ELISA 检测方法
• 5.4.2 GICA 检测方法
• 5.4.3 HPLC 检测方法
• 5.4.4 三种检测方法的比较
• 5.5 讨论
• 5.6 本章小结
• 主要结论
• 问题与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文