加工番茄与ToMV和CMV相关蛋白相互作用的初步研究

论文摘要

植物病毒侵入寄主植物并导致发病的能力与寄主和病毒相关分子间的相互作用关系密切。这种相互作用直接影响病毒在寄主体内的复制,细胞间的运动,系统性扩散,病症的轻重以及激发寄主产生抗病性等。目前已有研究证明,许多寄主因子与病毒基因编码的蛋白,如外壳蛋白（coat protein, CP）,运动蛋白（movement protein, MP）和复制酶蛋白（RNA-dependent RNA polymerase, RDRP）发生相互作用,然而,这种在病毒致病性和寄主植物抗病毒相互作用机制尚未研究透彻。酵母双杂交系统是研究蛋白质间相互作用的一种有效的方法。该系统能迅速、敏感地在真核细胞体内检测蛋白生理状态下的互作,具有操作简便、灵敏度高的特点,已在植物病毒学领域得到广泛应用。在新疆近年来随着种植面积的扩大,栽培技术的调整,病毒的适应性变异等因素的影响,加工番茄病毒病具有大面积爆发流行趋势,严重影响加工番茄的品质,成为制约新疆番茄产业健康持续发展的重要因素。本研究选取对新疆加工番茄危害较重的番茄花叶病毒（Tomato mosaic virus,ToMV）和黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）,分别选取ToMV的CP和MP基因以及CMV的2b基因,通过RT-PCR扩增目的片段,分别将其构建到酵母双杂交诱饵载体pSos上,获得了诱饵蛋白pSos-CP、pSos-MP和pSos-2b。将上述重组子分别单独转化到酵母菌cdc25H中。结果显示：CP、MP和2b三个蛋白对酵母菌cdc25H都未表现出毒性和自激活活性。同时提取混合接种ToMV和CMV诱导的加工番茄叶片总RNA,通过CytoTrap XR library construction kit合成了双链cDNA,之后用EcoR I和Xho I双酶切将cDNA片段定向插入到表达载体pMyr中,转化受体菌XL10-Gold,构建了酵母双杂交加工番茄cDNA文库。文库质量鉴定表明：所构建的初始文库滴度分别为1.5×106cfu/mL,扩增文库滴度为3.0×109cfu/mL。文库重组率均大于98%,文库cDNA插入片段长度大多集中分布在700-2000bp之间,表明文库质量良好。抽提纯化文库质粒,分别将其与诱饵质粒pSos-CP、pSos-MP和pSos-2b共转化酵母菌cdc25H中,在37℃半乳糖诱导下筛选可能与诱饵蛋白互作的阳性克隆,经过氨基酸缺陷和温度限制筛选可能的阳性克隆。用不同的诱饵初步筛选cDNA文库分别获得了不同阳性克隆：以pSos-CP为诱饵,从文库中筛选获得9个阳性克隆；以pSos-MP为诱饵,从文库中筛选获得28个阳性克隆；以pSos-2b为诱饵,从文库中筛选获得7个阳性克隆。通过PCR鉴定阳性克隆子中cDNA插入片段的大小和酶切验证后测序。在NCBI数据库中对测序结果进行Blast分析,根据数据库中阳性克隆对应同源序列的相关信息,对相同的克隆进行分类合并。该试验结果还有待于进一步的验证分析。本研究首次利用酵母双杂交系统从加工番茄cDNA文库中筛选了可能与ToMV CP、MP和CMV2b具有互作关系的寄主基因,为进一步验证相关抗病基因及其编码蛋白的功能,研究加工番茄与ToMV和CMV互作机理及培育抗病毒加工番茄种质资源新材料奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 中英符号缩略词表
• 目录
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.1 番茄病毒病及番茄抗病毒研究进展
• 1.2 黄瓜花叶病毒的研究概况
• 1.2.1 黄瓜花叶病毒的生物学特性
• 1.2.2 黄瓜花叶病毒基因组结构
• 1.3 番茄花叶病毒研究概况
• 1.3.1 ToMV的生物学特性
• 1.3.2 ToMV的基因组结构
• 1.4 酵母双杂交技术的应用研究进展
• 1.4.1 传统酵母双杂交技术
• 1.4.2 Cyto Trap酵母双杂交系统
• 1.4.3 酵母双杂交技术的应用现状
• 1.4.4 酵母双杂交技术在植物病毒学中的应用
• 1.5 本课题的主要目的和研究方法
• 第二章 诱饵载体的构建及验证
• 2.1 材料
• 2.1.1 本实验所用的菌株和质粒载体
• 2.1.2 常用试剂及试剂盒
• 2.1.3 酵母常用试剂及培养基的配制
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 目的片段的制备
• 2.2.2 诱饵载体的制备
• 2.2.3 诱饵菌株转录自激活性及毒性的检测
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 ToMV CP,MP和CMV 2b基因的扩增
• 2.3.2 重组质粒的酶切鉴定
• 2.3.3 酵母菌株cdc25H的表型验证
• 2.3.4 诱饵蛋白毒性及转录活性的检测分析
• 2.4 小结与讨论
• 第三章 加工番茄cDNA文库制备
• 3.1 材料
• 3.1.1 加工番茄的组织样品
• 3.1.2 常用试剂及试剂盒
• 3.1.3 引物
• 3.2 方法
• 3.2.1 接种CMV和ToMV
• 3.2.2 加工番茄总RNA提取和mRNA分离纯化
• 3.2.3 加工番茄文库双链cDNA的合成
• 3.2.4 cDNA末端的钝化及接头的连接
• 3.2.5 EcoRⅠ末端的磷酸化及酶切
• 3.2.6 cDNA纯化回收与pMyr载体的连接及转化
• 3.2.7 cDNA文库的鉴定与保存和扩增文库滴度测定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 总RNA的提取及mRNA的分离
• 3.3.2 双链cDNA的合成纯化结果
• 3.3.3 库容量、插入片段的重组率和大小
• 3.3.4 文库的扩增及滴度检测
• 3.4 小结与讨论
• 第四章 酵母双杂交筛选与CP,MP,2b相互作用的基因
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌株、质粒与载体
• 4.1.2 主要试剂及培养基
• 4.2 方法
• 4.2.1 用共转化方法筛选与CP,MP,2b互作的基因
• 4.2.2 对照菌株的小量转化
• 4.2.3 阳性克隆的初步筛选与鉴定
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 共转化结果
• 4.3.2 菌落PCR鉴定结果
• 4.3.3 阳性克隆质粒酶切鉴定结果
• 4.4. 阳性克隆测序及序列比对结果
• 4.5 小结与讨论
• 第五章 结果与讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介
• 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表