野黄芩素对基质金属蛋白酶抑制机理的研究

论文摘要

细胞外基质是存在于细胞周围的复杂结构。主要有三类生物大分子组成:结构蛋白,特异蛋白和蛋白多糖。细胞外基质可被多种蛋白水解酶降解。这些水解酶在肿瘤的浸润和转移中起到重要作用,并于肿瘤细胞的增殖,肿瘤细胞逃避机体免疫系统和肿瘤血管新生起重要作用。因此,细胞外基质降解酶如基质金属蛋白酶成为抗肿瘤转移的重要靶点。基质金属蛋白酶由超过20种含有锌离子的内肽酶组成。该家族蛋白酶可降解各种细胞外基质成分。由于基质金属蛋白酶与肿瘤密切相关,参与到肿瘤外周组织的降解和转移中。因此基质金属蛋白酶抑制剂可用来阻断肿瘤的发展。我们实验室成功表达了包涵体形式基质金属蛋白酶,首先优化了包涵体表达条件,并对目的蛋白进行表达和纯化,然后对纯化蛋白进行包涵体复性,并分析复性蛋白活性及其他动力学参数如Km,Kcat确定酶将底物转化为产物的效率。利用复性的蛋白从传统中药库中筛选MMPs抑制剂,野黄芩素。利用分子对接方法分析野黄芩素与基质金属蛋白酶的作用位点,发现该抑制剂结合到基质金属蛋白酶的S1或S1’口袋中。在分子和细胞水平上研究野黄芩素对HT1080细胞表达基质金属蛋白酶的影响,研究表明,在蛋白水平上,野黄芩素可抑制基质金属蛋白酶-14的表达;在mRNA水平上,野黄芩素可抑制基质金属蛋白酶-2,3,7,9,14,15的转录,该抑制作用具有剂量和时间依赖性。通过酶谱电泳检测发现,野黄芩素可抑制细胞培养上清中基质金属蛋白酶2和9的活性,且该抑制具有剂量和时间依赖型。此外,细胞行为实验结果表明,野黄芩素可抑制肿瘤细胞的浸润和转移。根据免疫印迹实验结果,野黄芩素对基质金属蛋白酶和肿瘤细胞的抑制作用与Wnt信号途径相关。

论文目录

• 提要
• 第一章 前言
• 1. 细胞外基质
• 2. 基质金属蛋白酶
• 2.1 基质金属蛋白酶简介
• 2.2 基质金属蛋白酶结构
• 2.3 基质金属蛋白酶的分类
• 2.3.1 分泌型MMPs
• 2.3.2 膜型基质金属蛋白酶（MT-MMP）
• 2.3.3 其他的MMPs
• 2.4 基质金属蛋白酶的功能
• 2.5 MMP 的活化和调控
• 2.6 MMP 底物
• 2.7 MMPs 与疾病的关系
• 2.7.1 MMPs与心血管疾病
• 2.7.2 MMPs与组织纤维化
• 2.7.3 MMPs与关节炎
• 2.7.4 MMPs与肿瘤
• 2.7.5 MMPs 和脑部缺血与再灌注
• 3. 本论文的研究目的和策略
• 第二章 重组MMP-16的表达、纯化和复性
• 1. 前言
• 1.1 概述
• 1.2 MT3-MMP/MMP-16
• 1.3 包涵体复性
• 1.4 复性蛋白质的检测
• 2. 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 细胞株
• 2.3 仪器
• 2.4 试剂
• 2.4.1 包涵体分离纯化试剂
• 2.4.2 SDS-PAGE 电泳试剂
• 2.4.3 包涵体处理试剂
• 2.4.4 Zymography 电泳试剂
• 3. 方法
• 3.1 MT3-MMP 的诱导表达
• 3.2 包涵体的分离和洗涤
• 3.3 包涵体的溶解
• 3.4 MT3-MMP 包涵体的金属螯合层析
• 3.5 HPLC
• 3.6 凝胶过滤柱复性
• 3.7 MT3-MMP 活力检测
• 3.8 计算Km 和Kcat/Km
• 4. 结果和讨论
• 4.1 MT3-MMP 的诱导表达
• 4.2 MT3-MMP 表达产物包涵体的洗涤
• 4.3 包涵体的溶解
• 4.4 MT3-MMP 包涵体蛋白的金属螯合层析
• 4.5 HPLC
• 4.6 凝胶过滤柱复性
• 4.7 计算Km 和Kcat/Km
• 5. 结论
• 第三章 基质金属蛋白酶抑制剂的筛选
• 1. 前言
• 1.1 基质金属蛋白酶抑制剂
• 1.2 黄酮类天然产物
• 1.2.1 生物类黄酮的抗癌作用
• 1.2.2 生物类黄酮抗癌机理探讨
• 1.3 对MMP 有抑制的黄酮类化合物
• 2. 材料与方法
• 2.1 主要试剂和实验材料
• 2.2 用于筛选的化合物
• 2.3 仪器
• 2.4 试剂
• 2.5 方法
• 3. 结果和讨论
• 3.1 检测到的对MMPs 有较好抑制的黄酮类化合物：野黄芩素（Scutellarein）
• 3.1.1 理化性质
• 3.1.2 主要用途和药理功能
• 3.2 野黄芩素对MMP 的抑制活性
• 4. 结论
• 第四章 用分子模拟方法研究MMPs 与抑制剂分子的相互作用
• 1. 前言
• 1.1 概述
• 1.2 模型与计算方法
• 1.2.1 模型搭建与优化.
• 1.2.2 分子对接
• 1.2.3 分子动力学模拟
• 1.2.4 轨迹分析
• 2. 结果与讨论
• 2.1 蛋白质三维结构的筛选结果
• 2.2 MMP-1 和野黄芩素的分子对接与分子动力学模拟
• 2.3 MMP-3 和野黄芩素的分子对接与分子动力学模拟
• 2.4 MMP-7 和野黄芩素的分子对接与分子动力学模拟
• 2.5 MMP-8 和野黄芩素的分子对接与分子动力学模拟
• 2.6 MMP-9 和野黄芩素的分子对接与分子动力学模拟
• 2.7 MMP-13 和野黄芩素的分子对接与分子动力学模拟
• 2.8 MMP-16 和野黄芩素的分子对接与分子动力学模拟
• 3. 结论
• 第五章 野黄芩素对人纤维肉瘤细胞HT1080 的影响
• 1. 前言
• 1.1 概述
• 1.2 基质金属蛋白酶的转录及其调控
• 2. 材料和试剂
• 2.1 耗材
• 2.2 细胞株
• 2.3 仪器
• 2.4 试剂
• 2.4.1 SDS-PAGE电泳试剂
• 2.4.2 Zymography电泳试剂
• 2.4.3 免疫印迹试剂
• 2.4.4 细胞实验所用试剂
• 3. 方法
• 3.1 细胞培养
• 3.2 细胞总RNA 提取
• 3.3 RT-PCR
• 3.4 免疫印迹
• 3.5 蛋白浓度测定
• 3.6 Zymography检测细胞上清中MMP-2 / MMP-9 活性
• 3.7 细胞增殖实验
• 3.8 野黄芩素对HT1080细胞形态影响的观察
• 3.8.1 细胞迁移实验（细胞划痕法）
• 3.8.2 细胞伸展实验（细胞的三维培养）
• 4. 结果和讨论
• 4.1 细胞增殖实验结果
• 4.2 不同浓度的野黄芩素对HT1080 细胞表达MMPs 的影响
• 4.2.1 RT-PCR 结果
• 4.2.2 免疫印记结果
• 4.2.3 酶谱实验结果
• 4.3 20μM的野黄芩素作用HT1080细胞不同时间对细胞表达MMPs的影响
• 4.3.1 RT-PCR 实验结果
• 4.3.2 免疫印记实验结果
• 4.3.3 酶谱实验结果
• 4.4 野黄芩素对HT1080细胞迁移能力的影响
• 4.5 野黄芩素对HT1080 细胞伸展的影响
• 4.6 野黄芩素对HT1080 细胞侵润能力的影响
• 4.7 野黄芩素影响HT1080 细胞中MMPs 表达的分子机制研究
• 5. 讨论
• 小结
• 参考文献
• 博士期间发表论文
• 中文摘要
• 英文摘要
• 致谢