复合富血小板血浆的可注射藻酸盐组织工程骨的构建和体外增殖、矿化的实验研究

论文摘要

目的:观察富血小板血浆（Platelet-Rich Plasma,PRP）,作为一种生长因子,在可注射藻酸盐（Alginate,A）骨组织工程（Bone Tissue Engineering）中对成骨细胞（Osteoblasts,OBs）增殖及矿化功能的影响,探讨可注射藻酸盐骨组织工程复合富血小板血浆的可行性。方法:①体外大鼠成骨细胞OBs的分离、培养及鉴定:取新生Wistar大鼠颅骨,采用多次酶消化法分离OBs,进行体外培养,Gomori钙钻法碱性磷酸酶染色和茜素红矿化结节染色鉴定OBs。②MTT法检测细胞的增殖及活力:取第三代Wistar大鼠成骨细胞与1.5%藻酸盐、富血小板血浆复合。实验分三组,1.实验组（成骨细胞/藻酸盐/20%PRP）;2.对照组（成骨细胞/藻酸盐）;3.成骨细胞贴壁生长组。体外连续培养14d,分别于培养的第2、3、4、5、6、7、10、12、14d,行MTT法检测实验组、对照组与贴壁生长细胞增殖能力,酶标仪测定光密度值（OD值）,每个样本设三个复孔,求其平均值并绘制细胞生长曲线。③荧光四环素标记法行矿化结节测定:取第三代Wistar大鼠成骨细胞,与1.5%藻酸盐支架材料和富血小板血浆复合。实验分三组,1.实验组（成骨细胞/藻酸盐/20%PRP）;2.对照组（成骨细胞/藻酸盐）;3.成骨细胞贴壁生长组。在培养的第14d、24d、31d,对实验组、对照组与单层培养组,行荧光四环素法标记矿化结节,倒置荧光显微镜下观察各组矿化情况,分别统计各组不同时间点的矿化结节数目、矿化面积百分数。结果:①成骨细胞鉴定:Gomori钙钻法碱性磷酸酶染色后细胞呈强阳性反应,胞浆内呈现灰黑色颗粒或块状沉淀;茜素红矿化结节染色后矿化结节呈现深红色,结节周围细胞胞浆也呈红染。②MTT法检测细胞的增殖及活力:与单层培养相比,成骨细胞藻酸盐三维培养未见明显的细胞毒性,在培养周期内细胞增殖一直呈上升趋势。含20%PRP藻酸盐三维培养组增殖能力明显高于无PRP的三维培养组,差异具有统计学意义（P＜0.05）,尤其是培养的第3-6d。③荧光四环素标记法矿化结节测定:与单层培养相比,成骨细胞藻酸盐三维培养的荧光强度、数目、面积,在培养周期内随培养时间延长而一直呈增多增大的趋势。与对照组相比,含20%PRP实验组的矿化结节数目增多、矿化面积增大,组间各时间点的差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论:①成骨细胞的藻酸盐三维培养体系,细胞代谢活性及功能接近、甚至优于单层培养。②成骨细胞/藻酸盐/PRP复合物,三者能很好的结合,均匀分布,三维培养下,能促进成骨细胞大量增殖,其构建可行。③PRP作为藻酸盐组织工程骨的生长因子,能促进成骨细胞矿化功能。

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