论文摘要
第一部分脂多糖通过上调Toll样受体表达、激活MAPK通路和NF-κB通路,介导星形胶质细胞的生长双重性目的:研究不同浓度脂多糖作用于星形胶质细胞不同时间后星形胶质细胞的生长特性,脂多糖受体表达情况,星形胶质细胞内部信号通路激活情况。方法:在原代培养的星形胶质细胞中加入不同浓度的脂多糖分别作用不同时间,观察星形胶质细胞生长的情况,MAPK通路抑制剂和NF-κB通路抑制剂对星形胶质细胞生长的影响。同时以不同浓度的LPS作用于星形胶质细胞24h后,观察随后8d星形胶质细胞生长的变化。通过RT-PCR、Western-blot、免疫细胞化学的方法观察星形胶质细胞Toll样受体的基因水平、蛋白水平和细胞水平的表达。Western-blot检测星形胶质细胞细胞内转录因子p65和P-p38的表达情况,观察MAPK通路抑制剂对P-p38表达及NF-κB通路抑制剂对p65表达的影响。结果:只有在作用24h后,低剂量的脂多糖才可使星形胶质细胞的生长加快,高剂量的脂多糖则可抑制星形胶质细胞的增殖。以≤10mg/L的脂多糖作用于星形胶质细胞24h后,短期内都可促进星形胶质细胞的生长,长期则抑制星形胶质细胞生长,脂多糖浓度越大,抑制细胞生长的能力越明显。NF-κB通路抑制剂、MAPK通路抑制剂皆可阻断脂多糖对星形胶质细胞生长的影响。在正常状况下,星形胶质细胞在胞浆和胞膜表达大量的TLR3受体,很少的TLR4受体。在脂多糖的刺激下,星形胶质细胞的TLR3受体表达保持不变,TLR4受体的表达随予以脂多糖的浓度增加而增高。予以10mg/L脂多糖作用于星形胶质细胞不同时间,我们发现星形胶质细胞内各组皆有P-p38表达,基础水平为内参GAPDH的0.176±0.021倍,30min后明显升高,24h后达到高峰,达GAPDH的0.435±0.044倍,随后逐渐减弱,48h组和72h组仅为GAPDH的0.287±0.028倍。预先加用MAPK通路抑制剂PD98059可下调P-p38的表达。同样,p65蛋白表达高峰出现在24h,随后下降, NF-κB通路抑制剂可阻断p65蛋白的升高。结论:低剂量的脂多糖可促进星形胶质细胞生长,高剂量时则抑制星形胶质细胞生长,而炎症刺激对星形胶质细胞的长期影响是对细胞的生长增殖起抑制作用。星形胶质细胞Toll样受体的表达是不同源的,TLR4随环境的变化而改变。其分子机制可能与NF-κB通路、MAPK通路的激活有关。第二部分星形胶质细胞在脂多糖诱导的多巴胺能神经元损伤中起双重作用目的:（1）建立含有高比例多巴胺能神经元的神经元培养体系。（2）建立星形胶质细胞和神经元的共培养体系。（3）研究星形胶质细胞在不同浓度脂多糖诱导的多巴胺能神经元损伤中的作用。方法:利用L-抗坏血酸-2-磷酸酯倍半镁盐和人成纤维生长因子促进孕12d的SD大鼠中脑前体细胞扩增、分化为多巴胺能神经元,通过阿糖胞苷抑制胶质细胞的增殖,建立高比例多巴胺能神经元的神经元培养体系。原代培养纯化的星形胶质细胞,使用终浓度为0、0.1、10mg/L脂多糖分别作用于星形胶质细胞24h,收集细胞上清液,高速离心,去除杂质,获得星形胶质细胞条件培养液（ACM）。在此基础上,利用transwell双室培养系统建立星形胶质细胞和神经元共培养体系,观察脂多糖、星形胶质细胞条件培养液和星形胶质细胞对神经元培养体系中多巴胺能神经元存活及酪氨酸羟化酶mRNA表达的影响。结果:脂多糖对神经元体系中的多巴胺能神经元有损伤作用,并呈剂量依赖性。同单用脂多糖相比,条件培养液显著促进多巴胺能神经元的存活,其中0.1mg/L脂多糖处理的ACM组多巴胺能神经元的存活能力最强,其次为10mg/L组,最后为0mg/L组。同条件培养液组相比,共培养体系中多巴胺能神经元存活能力更高,其中0.1mg/L脂多糖干预后多巴胺能神经元的存活能力最强,随后依次为10mg/L、0mg/L、20mg/L脂多糖。多巴胺能神经元表达酪氨酸羟化酶mRNA的变化类似多巴胺能神经元数量的变化。结论:脂多糖对多巴胺能神经元有损伤作用,并呈剂量依赖性,适度激活的星形胶质细胞对多巴胺能神经元有保护作用,过度激活则削弱了这种保护作用,星形胶质细胞和多巴胺能神经元之间的对话可进一步增加多巴胺能神经元的存活。第三部分脂多糖刺激的星形胶质细胞可能通过IL-6介导PC12细胞增殖双重性目的:研究脂多糖刺激的星形胶质细胞条件培养液对PC12细胞生长的影响及其可能的因子。方法:在原代培养的星形胶质细胞中加入不同浓度的脂多糖作用24h,收集条件培养液,用不同分子量的过滤单位（Ultrafree MC filter units）将培养液进行分层处理,观察不同分子量范围的星形胶质细胞条件培养液对PC12细胞生长的影响,同时对星形胶质细胞的条件培养液中的细胞因子进行分析,观察以不同浓度的脂多糖作用24h后,星形胶质细胞分泌的细胞因子的变化。观察重组IL-6和加用IL-6中和抗体后的星形胶质细胞条件培养液对PC12细胞生长的影响。最后在含高比例多巴胺能神经元的神经元培养体系中,加用添加IL-6中和抗体的星形胶质细胞条件培养液,观察他们对多巴胺能神经元存活及酪氨酸羟化酶mRNA表达的影响。结果:星形胶质细胞条件培养液可促进PC12细胞的增殖,低剂量的脂多糖刺激的星形胶质细胞条件培养液可增强星形胶质细胞对PC12细胞的增殖作用,高剂量的脂多糖则可削弱星形胶质细胞对PC12细胞的影响。5-30KDa分子量范围的星形胶质细胞条件培养液对PC12细胞的影响最大。以脂多糖作用星形胶质细胞24 h后,脂多糖可促进星形胶质细胞分泌IL-6,并呈剂量依赖性,GDNF、TNF-α、NO的分泌影响不大,未达统计性差异。低剂量脂多糖促进GSH合成、上调GPx活性,高剂量则起相反作用,重组IL-6可模拟星形胶质细胞条件培养液的作用,IL-6中和抗体可阻断星形胶质细胞条件培养液的这种效应。IL-6中和抗体加入到ACM中,消除ACM中IL-6的作用后,0、0.1mg/L脂多糖处理组多巴胺能神经元的数量下降,细胞突起变短,暗淡,但10mg/L脂多糖处理组多巴胺能神经元的数量没有下降,突起较未加IL-6中和抗体前延长、明亮,并且消除了星形胶质细胞对多巴胺能神经元的双重作用。细胞中酪氨酸羟化酶mRNA的变化类似于细胞数量的变化。结论:星形胶质细胞可促进PC12细胞的活存和增殖,星形胶质细胞的适度激活上调星形胶质细胞对PC12细胞的保护作用,而过度激活则削弱了星形胶质细胞的保护作用。不是通过调节GDNF的合成,而是诱导致炎因子的变化、抗氧化分子的多寡介导星形胶质细胞的双重性,IL-6可能是关键的因素之一。