冬虫夏草与蛹虫草原生质体融合研究

论文摘要

冬虫夏草是我国特有的传统名贵中药，具有多种药用价值。但由于其生长环境特殊，目前难以实现规模化人工栽培。蛹虫草与冬虫夏草极为相似，分布广泛，在中、低海拔地区即可人工栽培。实验采用原生质体融合技术，对冬虫夏草与蛹虫草的原生质体制备、再生、融合条件进行了研究，并对融合子进行了初步筛选和鉴定，以期获得兼具二者所长的融合子，将来可以成为冬虫夏草的人工替代品。实验采用正交设计方法，对冬虫夏草和蛹虫草原生质体的制备与再生系统进行了综合研究，得到最佳体系组成为液体静置培养3d的菌丝体，分别以2．0％溶壁酶+1．0％蜗牛酶和2．0％溶壁酶+1．0％纤维素酶为酶液组合，0．6mol／L的KCl作为原生质体制备的渗稳剂，0．6mol／L的甘露醇加入最佳液体培养基中作为再生培养基的渗稳剂，分别在32℃和30℃酶解2h。最佳条件下，冬虫夏草和蛹虫草原生质体的制备率分别达到2．98×108／mL和2．083×107／mL；再生率分别达到42．09×10-1％和35．43×10-1％。实验采用双灭活法进行标记，将冬虫夏草和蛹虫草原生质体融合。结果表明，冬虫夏草采用热灭活，60℃处理10min；蛹虫草采用紫外灭活，距离30W的紫外灯下10cm处垂直照射13min，致死率均达到100％。冬虫夏草和蛹虫草原生质体融合的最佳条件是以40％PEG与80mmol／LCaCl2的混合溶液（pH7）进行助融，35℃融合20min，原生质体融合频率达到2．74×10-5。通过对菌落表型、生长速度、颉颃现象进行观察，并结合RAPD分子标记对融合子进行了验证，证明融合子是冬虫夏草和蛹虫草原生质体融合的产物。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 原生质体融合的研究进展
• 2 原生质体融合的技术路线
• 2.1 亲本原生质体的制备
• 2.1.1 材料的选取
• 2.1.2 培养方法
• 2.1.3 菌丝培养方式
• 2.1.4 菌龄
• 2.1.5 酶种类的选择
• 2.1.6 酶液组分及浓度配比
• 2.1.7 酶解温度和时间
• 2.1.8 渗透压稳定剂
• 2.2 亲本原生质体的再生
• 2.3 对出发菌株的标记
• 2.3.1 营养缺陷型标记
• 2.3.2 抗药性标记
• 2.3.3 荧光染色标记
• 2.3.4 灭活标记
• 2.3.5 自然标记
• 2.4 原生质体融合
• 2.4.1 离心法
• 2.4.2 融合剂诱导法
• 2.4.3 电融合法
• 2.4.4 激光诱导的细胞融合技术
• 2.5 融合子的鉴定
• 2.5.1 生物学方法
• 2.5.2 生化方面的鉴定
• 2.5.3 分子生物学鉴定方法
• 3 出发菌株的研究概况及意义
• 4 虫草与蛹虫草原生质体融合的技术路线
• 第二章 两亲本菌株菌丝体最佳液体培养基的筛选
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 供试菌种
• 1.1.2 实验试剂
• 1.1.3 仪器设备
• 1.1.4 培养基
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 固体培养与提纯复壮
• 1.2.2 出发菌株颉颃实验
• 1.2.3 液体培养基的筛选
• 2 结果与分析
• 2.1 固体培养与提纯复壮
• 2.2 出发菌株颉颃实验
• 2.3 初选实验结果
• 2.4 比较实验结果
• 2.5 正交实验结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 5 小结
• 第三章 两亲本菌株原生质体制备与再生条件的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 供试菌种
• 1.1.2 实验试剂
• 1.1.3 仪器设备
• 1.1.4 培养基
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 液体培养
• 1.2.2 两亲本原生质体的制备
• 1.2.3 两亲本原生质体的再生
• 1.2.4 正交实验设计
• 2 结果与分析
• 2.1 原生质体的释放方式
• 2.2 影响原生质体制备的诸因素分析
• 2.3 渗稳剂种类与原生质体再生的关系
• 3 讨论
• 3.1 关于影响原生质体制备的相关因素探讨
• 3.1.1 菌丝体形态对原生质体得率的影响
• 3.1.2 菌龄对原生质体得率的影响
• 3.1.3 酶液组分对原生质体得率的影响
• 3.1.4 酶解温度、时间对原生质体得率的影响
• 3.1.5 酶解方式对原生质体得率的影响
• 3.2 关于影响原生质体再生的相关因素探讨
• 3.2.1 破壁后的残余胞壁组分对再生的影响
• 3.2.2 培养基成分对再生的影响
• 3.2.3 渗稳剂对原生质体得率、再生率的影响
• 4 结论
• 5 原生质体制备前后菌丝体几方面比较
• 5.1 菌落形态与菌丝长势比较
• 5.2 菌丝体生长速度比较
• 5.3 颉颃实验
• 6 小结
• 第四章 灭活标记及原生质体融合
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 双亲菌株的原生质体
• 1.1.2 实验试剂
• 1.1.3 仪器设备
• 1.1.4 培养基
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 热灭活标记冬虫夏草
• 1.2.2 紫外灭活标记蛹虫草
• 1.2.3 原生质体融合
• 1.2.4 融合正交实验
• 2 结果与分析
• 2.1 热灭活实验结果与分析
• 2.2 紫外灭活实验结果与分析
• 2.3 影响原生质体融合的诸因素分析
• 3 讨论
• 3.1 灭活标记两亲本
• 3.2 对影响融合的诸多因素探讨
• 3.2.1 促融剂（fusogen）PEG浓度
• 3.2.2 无机离子
• 3.2.3 pH
• 3.2.4 融合温度
• 3.2.5 融合时间
• 4 小结
• 第五章 融合株的鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 供试菌种
• 1.1.2 实验试剂
• 1.1.3 RAPD-PCR反应所用随机引物
• 1.1.4 仪器设备
• 1.1.5 培养基
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 双亲与融合株生长速率比较
• 1.2.2 颉颃实验,比较种间菌落特征
• 1.2.3 RAPD-PCR方法鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 三菌株生长速率比较结果
• 2.2 颉颃实验结果
• 2.3 DNA纯度检测
• 2.4 融合子与亲本的遗传相关性分析
• 3 讨论
• 4 小结
• 第六章 实验总结
• 1 原生质体的制备与再生
• 2 遗传标记双亲
• 3 原生质体融合
• 4 融合株鉴定
• 5 有待改进的环节
• 6 研究的创新之处
• 参考文献
• 致谢