论文摘要
单宁酶(tannin acyl hydrolase,EC 3.1.1.20)能够专一性水解桔酸酯键,但其市场价格昂贵、使用寿命较短,将其固定化能够提高酶的稳定性以及重复使用率。桔酸烷基酯是一类优良安全的天然抗氧化剂,具有预防心脑血管疾病、清除体内自由基、提高免疫力等功效,其中桔酸丙酯作为食品抗氧化剂的商品名叫“通脉酯”。传统工业上,桔酸烷基酯的合成通常用浓硫酸作催化剂,能耗大、污染环境、制备时间长、副反应产物多,且严重腐蚀设备;而生物合成法具有反应条件温和、环境友好、副反应少等诸多优点,具有很好的应用前景。目前有关有机介质体系中生物合成棓酸烷基酯的规律还未有深入研究,且直接利用微生物细胞合成棓酸烷基酯的研究在国内外未见报道。本文对有机介质体系中生物合成棓酸烷基酯键的规律进行了深入的研究,以游离单宁酶、固定化单宁酶、游离黑曲霉菌丝和固定化黑曲霉菌丝为催化剂载体,考察了有机介质体系的各种影响因素,并构建了有机介质体系中黑曲霉菌丝合成棓酸丙酯的反应动力学模型。同时构建了巴斯德毕赤酵母基因工程菌进行胞内表达和分泌表达单宁酶,得到较高单宁酶活力的菌种并直接应用于生物合成棓酸烷基酯。 一、首先构建了海藻酸钙微胶囊固定化单宁酶的方法,并研究比较了固定化酶和游离酶的酶学性质。结果表明海藻酸钙固定化单宁酶以及游离单宁酶的最适pH和最适反应温度分别为6.0和40℃、5.0和30℃;固定化酶的温度稳定性和pH稳定性均有提高,经过15个循环的反应相对活力只下降了10%,说明海藻酸钙固定化单宁酶能够有效提高稳定性和重复利用率。同时构建了海藻酸钙—壳聚糖固定化单宁酶,其在有机介质体系中合成棓酸丙酯的合成率为34.59%,比游离酶高19.2%。考察了水和有机溶剂对棓酸丙酯合成的影响,反应达到平衡后加入除水剂分子筛能够有效促进平衡向酯化方向移动,合成率提高了10%;在极性较强或疏水性较强的有机溶剂中合成率较低,在中等疏水性的有机溶剂苯和正己烷中合成率较高,分别为44.3%和35.7%。 二、固定化黑曲霉菌丝和游离黑曲霉菌丝有机介质体系中合成棓酸丙酯的规律研究表明,两者均在有机溶剂苯中活力较高,合成率相近分别为26.8%和25.9%,然而固定化菌丝达到反应平衡的时间比游离菌丝长48h,可见游离菌丝作为单宁酶的优良天然载体,其综合催化性能优于固定化菌丝,因此利用游离菌丝进行进一步的研究。考察了菌丝制备方式、有机溶剂、菌丝量、水活度、底物浓度、扩散限制、温度等对黑曲霉菌丝合成棓酸丙酯的影响,结果显示真空干燥处理的菌丝在pH 3.6、水含量71.4%左右时能保持较高的活力;在由10ml苯、0.35g菌丝、5.56 mmol L-1棓酸、7.3%(V/V)正丙醇、0.5%(W/V)聚乙二醇10000组成的
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