陆地棉逆境胁迫相关同源基因的克隆及其在非生物胁迫下的表达特性分析

论文摘要

干旱、盐碱、低温和冻害等非生物逆境是影响植物生长发育的主要环境因素,严重地制约着农作物产量与品质的提高。在逆境胁迫下,植物能感知、传递胁迫信号,通过激活响应转录因子,启动抗逆功能基因的表达,使植物体内发生一系列的生理生化反应,抵御不良环境的危害,从而提高植物的耐逆性。NAC转录因子基因家族是植物所特有的基因家族,也是植物中最大的基因家族之一。NAC转录因子最初来源于矮牵牛NAM基因和拟南芥ATAF1, ATAF2和CUC基因的一段共有的序列。近年来,通过对大量NAC型转录因子基因的功能和特征分析证明该家族基因在植物的胁迫应答过程中起着重要的作用。碱性／螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子家族是一个在动植物中广泛存在的功能多样性的基因家族。近年来,从已经获得全基因组序列的物种中鉴定了几百个bHLH型转录因子基因。一些植物的bHLH型转录因子也被鉴定和特征分析,其功能涉及生长发育以及胁迫响应等。然而,bHLH型转录因子家族的大多数成员仍有待于研究。棉花是世界性的重要经济作物,其中陆地棉占全球棉花种植面积的95%以上,然而在其生长区域频繁遭受着干旱、高盐、低温等非生物胁迫的侵袭,严重影响着棉花的生长发育和产量的提高。本研究选用我国生产上广泛利用的抗逆品种陆地棉晋棉19为试验材料,选择了与胁迫相关的NAC型以及bHLH型转录因子基因进行研究,以期获得在作物抗逆性改良方面具有应用潜力的候选转录因子基因,对棉花的抗逆育种以及阐述棉花耐受胁迫的分子机制都有着重要的意义。本研究取得了以下研究进展：首次从陆地棉晋棉19中分离到了6个NAC型胁迫相关转录因子GhNAC1-GhNAC6.在拟南芥中,NAC基因在非生物胁迫的信号调控中起着重要的作用。我们把这个结果拓展到了棉花上,利用拟南芥的NAC基因氨基酸序列为搜索探针扫描陆地棉EST数据库,重叠候选的ESTs,我们从陆地棉中获得了6个推测的编码NAC型蛋白的全长cDNA序列。根据推测的这6个全长cDNA序列,我们设计了巢式PCR引物对和横跨全长ORF的PCR引物对,然后将这6个NAC型胁迫相关的转录因子GhNACl-GhNAC6从陆地棉晋棉19的叶片中克隆。这六个全长的cDNA序列（GhNAC1-GhNAC6）,每个都含有一个单个完整的ORF,分别编码276,299,298,346,356和327个氨基酸,推测的分子量分别为31.9,33.8,33.9,38.4,40.2和37.0 KDa,等电点分别为5.83,5.74,6.54,8.87,8.17和5.39。这六个基因都具有保守的内含子／外显子结构,然而具有不同的内含子长度和染色体位置。GhNAC1-GhNAC6序列具有很高的相似性,特别是在NAC结构域区。半定量RT-PCR分析表明,这六个基因都能够在叶片中丰富的表达,而在根、茎和纤维中微量的表达或者不表达。实时定量RT-PCR分析表明,这六个基因不同程度的受到了干旱、高盐、低温和ABA的诱导。根据胁迫诱导的NAC蛋白系统进化树分析结果,我们鉴定的这6个陆地棉NAC蛋白分布在这5个亚家族中的4个,分别为ATAF, AtNAC3, NAP和NAM,它们中的3个亚家族,ATAF, AtNAC3和NAP类NAC基因蛋白已在大量植物中被证明参与生物与非生物环境的胁迫响应。首次从陆地棉晋棉19中分离到了bHLH型胁迫相关的转录因子GhbHLH1。众所周知,植物激素ABA在调控植物响应干旱胁迫中起着重要的作用,AtMYC2（和GhbHLH1同源）已经被证明其作为转录因子涉及拟南芥的干旱和ABA应答通路。本研究用AtMYC2的氨基酸序列为搜索探针扫描陆地棉EST数据库,重叠候选的ESTs,拼接出一个新的棉花bHLH转录因子的cDNA序列。根据这个拼接的cDNA序列,设计了一对横跨这个转录因子全长ORF的特异引物。最终,我们从胁迫诱导的陆地棉晋棉19的叶片cDNA中,利用RT-PCR的方法分离到了这个可能在棉花中调控ABA应答的重要基因（GhbHLH1）。全长GhbHLH1的cDNA序列有2025bp的开放阅读框,编码674个氨基酸,推测的分子量和等电点分别为73.6 kDa和5.46。序列比对表明,GhbHLHl蛋白含有一个60个氨基酸长的bHLH结构域,其氨基酸序列和拟南芥的bHLH转录因子有很高的同源关系,特别是和在胁迫反应中起重要作用的AtMYC2。半定量RT-PCR分析表明,GhbHLH1基因能够在根、茎、叶和开花7天后的纤维中组成性的表达,特别是在开花7天后的纤维中表达量最强。虽然GhbHLH1基因能够组成性的在根、茎、叶和开花7天后的纤维中表达,但是实时荧光定量RT-PCR表明在叶片中GhbHLH1的表达能够短暂的被ABA和PEG的处理所诱导,而GhbHLH1的表达却不被高盐和低温影响。GhbHLH1基因的进一步功能验证正在进行中。

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摘要

ABSTRACT

缩略词表

第一章参与非生物胁迫应答的植物转录因子

1. 植物在非生物胁迫下诱导表达的基因

2. 参与非生物胁迫应答的植物转录因子

2.1 植物转录因子的结构与特征

2.1.1 DNA结合域（DNA-binding Domain）

2.1.2 转录调控域（Transcription Regulation Domain）

2.1.3 寡聚化位点（Oligomerization Site）

2.1.4 核定位信号（Nuclear Location Signal,NLS）

2.2 参与非生物胁迫应答的植物转录因子

2.2.1 AP2/EREBP转录因子

2.2.2 bZIP转录因子

2.2.3 NAC转录因子

2.2.4 MYB转录因子

2.2.5 bHLH转录因子

2.2.6 锌指转录因子

3. 转录因子在植物抗逆基因工程中的应用

3.1 转录因子的复杂性

3.2 转录因子响应胁迫应答的保守性和多样性

3.3 转录因子在植物抗逆性改良中的应用

第二章 NAC和bHLH转录因子研究进展

1. NAC转录因子研究进展

1.1 NAC转录因子的结构特点及其分类

1.2 NAC转录因子的生物学功能

1.2.1 NAC转录因子在植物生长发育中的调节作用

1.2.2 NAC转录因子在改良作物品质中的作用

1.2.3 NAC转录因子在植物逆境和防御反应中的应用

2. bHLH转录因子研究进展

2.1 bHLH转录因子的结构、分类及进化

2.2 动物bHLH转录因子研究进展

2.3 植物bHLH转录因子研究现状

本研究的目的与意义

第三章陆地棉6个NAC转录因子家族成员的克隆与表达特性分析

1. 材料

1.1 植物材料

1.2 菌株

1.3 载体

1.4 网络资源及应用软件

1.5 酶及试剂

1.6 试剂盒

1.7 引物

2. 方法

2.1 陆地棉NAC蛋白同源EST的检索、组装及分析

2.2 感受态细胞的制备及大肠杆菌的转化

2.2.1 感受态细胞的制备

2.2.2 大肠杆菌的转化

2.3 棉花基因组DNA的提取方法

2.4 植物材料的胁迫处理

2.5 棉花总RNA的提取及cDNA第一链的合成

2.5.1 改进的热硼酸法

2.5.2 CTAB-酸酚法

2.5.3 DNaseI消化

2.5.4 cDNA第一链的合成

2.6 陆地棉NAC基因的PCR扩增

2.7 扩增产物的电泳,回收,克隆及测序

2.8 GhNACs染色体定位分析

2.9 半定量RT-PCR分析

2.10 实时荧光定量RT-PCR分析

2.10.1 实时荧光定量RT-PCR引物的特异性检测

2.10.2 实时荧光定量RT-PCR反应

2.10.3 数据分析

3. 结果与分析

3.1 陆地棉NAC转录因子家族新成员的克隆

3.1.1 陆地棉NAC蛋白同源EST的检索及电子延伸

3.1.2 陆地棉总DNA和RNA的质量分析

3.1.3 陆地棉GhNACs克隆的PCR鉴定

3.1.4 重组菌落的PCR鉴定

3.2 GhNACs基因的cDNA序列测定及部分特性分析

3.2.1 GhNAC1

3.2.2 GhNAC2

3.2.3 GhNAC3

3.2.4 GhNAC4

3.2.5 GhNAC5

3.2.6 GhNAC6

3.3 GhNACs基因的DNA序列测定及基因组结构分析

3.4 GhNACs基因的染色体定位分析

3.5 GhNACs基因氨基酸序列比较分析

3.6 GhNACs基因的组织特异性表达分析

3.7 GhNACs基因在非生物胁迫下的表达模式

3.8 胁迫诱导的NAC蛋白系统进化树分析

4.讨论

4.1 GhNACs基因的电子延伸

4.2 GhNACs基因涉及非生物胁迫

第四章 1个新的陆地棉bHLH转录因子家族成员的克隆及其对ABA和干旱胁迫的响应

1. 材料

2. 方法

3. 结果与分析

3.1 陆地棉bHLH转录因子的克隆

3.1.1 陆地棉AtMYC2蛋白同源EST的检索及电子延伸

3.1.2 陆地棉胁迫诱导总RNA的提取

3.1.3 陆地棉bHLH转录因子的PCR鉴定

3.1.4 重组菌落的PCR鉴定

3.2 GhbHLH1基因的cDNA序列测定及其部分特性分析

3.3 GhbHLH1基因的氨基酸序列分析

3.4 GhbHLH1基因的组织表达特性分析

3.5 GhbHLH1基因在非生物胁迫下的表达模式

4. 讨论

全文结论

参考文献

致谢

攻读博士学位期间发表的学术论文

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