丝瓜核糖体失活蛋白luffin-b基因的快速克隆、表达及体外定向进化的初步研究

论文摘要

目的：本文主要对丝瓜核糖体失活蛋白luffin-b基因进行了快速克隆、表达及定向进化的研究。方法：（1）查阅Genbank上已提交的丝瓜核糖体失活蛋白luffin-b基因的cDNA序列，根据此序列设计带有酶切位点的引物，以丝瓜总DNA为模板进行PCR扩增，并将PCR产物进行测序，然后进行比对，以检测其内含子的有无；（2）回收PCR产物，与克隆载体pUCm-T连接后，转化至E．coliDH5α中，完成luffin-b基因的克隆；（3）将PCR产物和表达载体pET-28a（+）分别进行双酶切，然后进行连接，先转化至E．coli DH5α中，挑取阳性克隆，再将阳性克隆转化至表达菌株BL21中，加IPTG进行诱导表达，并用SDS-PAGE鉴定重组蛋白；（4）利用易错PCR技术扩增luffin-b基因，将其转化至E．coli DH5α中，挑取阳性克隆，提取质粒，进行测序鉴定。结果：（1）电泳显示PCR产物分子量大小为约800bp，PCR产物测序的结果为855bp，经比对与已提交的cDNA序列同源性达到100％，由此可以说明：此基因没有内含子；（2）回收的PCR产物与克隆载体pUCm-T连接后，转化至E．coli DH5α中，并筛选出14个阳性克隆；（3）转入luffin-b基因的表达菌株BL21经IPTG诱导、表达出luffin-b融合蛋白，SDS-PAGE电泳显示分子量大小约为31KD；（4）通过易错PCR方法成功地使luffin-b基因发生了不同程度的突变，初步建立了一个突变体文库。结论：利用基因组PCR法鉴定了luffin-b基因没有内含子，从而为luffin-b基因以后的研究提供了一个简便易行的方法；另外，通过易错PCR方法对luffin-b基因进行的突变，也为核糖体失活蛋白luffin-b的体外定向进化提供了实验依据，建立了一个初步的技术平台。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 1.核糖体失活蛋白的研究进展
• 2.丝瓜核糖体失活蛋白的研究进展
• 3.蛋白质的定向进化
• 4.本课题研究的内容
• 材料和方法
• 1.材料
• 1.1 主要仪器和设备
• 1.2 器材及试验材料
• 1.3 主要试剂
• 1.4 试剂配制
• 1.5 菌株和载体
• 1.6 基因和引物序列
• 2.方法
• 第一部分 Iuffin-b基因的快速克隆
• 1.1 丝瓜籽基因组的提取
• 1.2 PCR反应扩增luffin-b基因
• 1.3 PCR产物测序
• 1.4 luffin-b基因的克隆
• 第二部分 Iuffin-b基因的表达
• 2.1 制备表达载体pET-28a（+）DNA
• 2.2 双酶切PCR产物和表达载体DNA
• 2.3 回收目的基因片段和表达载体分子
• 2.4 DNA分子的连接重组
• 2.5 重组质粒的抽提
• 2.6 重组质粒的鉴定
• 2.7 重组子转化受体菌
• 2.8 利用表达菌株表达luffin-b基因
• 2.9 表达产物的SDS-PAGE电泳鉴定
• 第三部分 Iuffin-b蛋白的体外定向进化
• 3.1 易错PCR
• 3.2 易错luffin-b基因克隆
• 3.3 阳性鉴定
• 实验结果
• 第一部分 Iuffin-b基因的快速克隆
• 1.1 Iuffin-b基因的扩增及测序
• 1.2 低熔点琼脂糖回收luffin-b基因
• 1.3 连接转化结果
• 1.4 重组质粒pUCm-T-luffin-b的测序结果
• 第二部分 Iuffin-b基因的的表达
• 2.1 PCR产物和表达载体pET-28a（+）DNA的双酶切电泳鉴定
• 2.2 luffin-b基因的重组克隆结果
• 2.3 重组子的鉴定
• 2.4 重组子转化表达菌株BL21后的克隆结果
• 2.5 luffin-b基因诱导表达后产物的SDS-PAGE分析
• 第三部分 Iuffin-b蛋白的体外定向进化
• 3.1 易错PCR产物电泳及测序结果
• 3.2 易错luffin-b基因转化至克隆菌株DH5α中的结果
• 讨论
• 1.研究luffin-b基因有无内含子的原因
• 2.研究最适诱导温度的原因
• 3.研究过程中遇到的问题及解决方法
• 4.取得的成绩及展望
• 5.本次研究的不足及原因分析
• 结论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间研究成果
• 附录 缩略词中英文对照表
• 致谢