论文摘要
鼻咽癌（Nasopharyngeal Carcinoma，NPC）是一种在东南亚及我国南方高发的上皮源性恶性肿瘤。流行病学及病因学研究表明遗传因素、爱泼斯坦-巴尔病毒（Epstein-Barr virus，EBV）的感染和饮食环境因素均与NPC的发生、发展有关。NPC显著的种族易感性和家族聚集现象表明遗传基因的改变在NPC中起十分重要的作用，但与鼻咽癌相关的分子遗传学改变所知不多。目前研究结果表明经典的已知抑瘤基因（Tumor SuppressorGenes，TSGs）如p53、Rb、p21、p16、VHL、FHIT等在鼻咽癌中的作用尚无定论，TP53蛋白的过度表达和p16基因的缺失虽然参与了鼻咽癌的发生、发展，但现有的研究不能确定其在鼻咽上皮恶变过程中的主导作用。本实验室前期工作通过分析鼻咽癌及其他肿瘤基因表达谱的结果选取了位于鼻咽癌高频缺失区3p21.3-22的LF（lactoferrin，LF）基因作为研究对象，探讨该基因与鼻咽癌发生发展的关系。前期工作证实，LF基因在76％鼻咽癌组织中表达缺失或下调；其表达的改变与基因的启动子区甲基化、杂合性丢失（loss of heterozygosity，LOH）、基因突变有关。这些研究结果表明LF基因很可能是一个与鼻咽癌癌变关系密切的候选抑瘤基因。本研究在前期工作的基础上，进一步分析了LF基因在鼻咽癌细胞系中的表达、遗传学和表遗传学改变。通过基因转染实验恢复鼻咽癌细胞系5-8F中LF基因的表达，并观察LF基因恢复表达后对5-8F细胞生物学特性的影响，明确LF基因在5-8F细胞中的作用，为LF基因与鼻咽癌发生发展相关性提供初步实验证据。实验方法和结果如下：第一部分鼻咽癌细胞系中LF基因表达及遗传学和表遗传学改变采用RT-PCR、Real-time RT-PCR方法检测LF基因在8例慢性鼻咽炎组织和7株鼻咽癌细胞（HNE1、HNE2、HNE3、CNE1、CNE2、5-8F、6-10B）中的表达，结果显示LF基因在慢性鼻咽炎组织中稳定表达，在所有鼻咽癌细胞系中表达缺失或下调（P=0.001）。为了进一步阐明LF基因在鼻咽癌细胞系中表达失活的分子机制，我们从遗传学（LOH、基因突变）和表遗传学（基因启动子区甲基化）两方面进行了分析。通过PCR-SSCP和测序方法分析了LF基因启动子区、第1外显子和第2外显子的突变情况。在7种鼻咽癌细胞系中我们仅检测到在HNE1细胞系存在LF基因启动子区突变（1076delC），而在其他位点和细胞系中未发现突变，即LF基因在鼻咽癌细胞系中的突变检测率为14％（1／7），推测该突变可能通过影响LF基因启动子与反式作用因子的结合，导致LF基因的表达失活。此外，我们的结果也证实了LF基因的第二外显子存在多态性。采用PCR-变性聚丙烯酰胺凝胶电泳-银染方法，对7种鼻咽癌细胞系中微卫星位点（D3S4169、GBD：181215、D3S1478、G59627和RH119558）的杂合性缺失情况进行了检测，结果仅发现CNE1细胞系在D3S1478位点存在LOH，其余细胞系及其它位点未发现LOH，即LF基因在鼻咽癌细胞系中的的LOH检测率为14％（1／7），提示微卫星位点的杂合性丢失可能对LF在鼻咽癌细胞中表达下调起了一定的作用。为了探讨LF基因启动子区甲基化与鼻咽癌细胞系中LF基因的表达缺失或下调之间是否存在关系，我们采用了甲基化特异性PCR方法检测了7种鼻咽癌细胞系中LF基因启动子区CpG岛甲基化情况。结果显示所有鼻咽癌细胞系中LF基因启动子区均存在甲基化，其中CNE2和5-8F细胞中LF基因启动子区存在不完全甲基化。这些结果说明启动子区高甲基化可能是鼻咽癌细胞系中LF基因表达失活的主要原因。第二部分鼻咽癌候选抑瘤基因LF功能的初步研究采用RT-PCR方法从慢性鼻咽炎组织中克隆LF基因的开放阅读框序列，测序结果显示该序列存在2个SNP位点和一个突变位点（9523A→T）。将LF基因的开放阅读框序列克隆到pcDNA3．1（-）载体中，构建了LF基因的真核表达载体（pcLF）。利用脂质体转染技术将pcLF导入5-8F细胞，G418筛选获得抗性克隆，进一步采用RT-PCR检测LF基因的mRNA表达，采用Western Blotting检测LF蛋白的表达，结果表明我们已成功地建立稳定转染pcLF的5-8F细胞系（5-8F-LF）。免疫细胞化学实验显示表达的LF蛋白主要定位于胞浆。随后我们检测了LF基因稳定表达后对5-8F细胞的生物学特性的影响。流式细胞分析结果表明，与对照组相比转染pcLF后可以使5-8F-LF细胞停滞于G1期，G1期细胞比例增加（62.28％vs51.81％），S期（24.54％vs27.80％）和G2-M期细胞比例减少（13.19％vs20.38％）。利用MTT法和平板克隆形成实验观察LF基因稳定表达后对5-8F细胞增殖能力和克隆形成能力的影响。MTT的结果表明5-8F-LF细胞的增殖速度明显低于对照组（P＜0.05）；平板克隆形成实验结果显示5-8F-LF细胞的克隆形成率明显低于对照组（28％vs54.7％）。提示LF基因稳定表达后导致5-8F细胞的增殖能力和克隆形成能力降低。本实验在前期工作的基础上，检测了LF基因在慢性鼻咽炎和鼻咽癌细胞系中的表达差异并分析了导致表达差异的可能机制，结果提示LF基因在鼻咽癌细胞中表达下调或缺失与LOH、基因突变和启动子区甲基化等有关，而启动子区甲基化可能起着主要作用。LF基因的稳定表达可以导致5-8F细胞停滞于G1期以及细胞增殖能力和克隆形成能力降低，提示LF基因很可能是一个与鼻咽癌癌变关系密切的候选抑瘤基因，但还需要更多的体内外实验进行证实。