猪胚胎体外生产技术的初步研究

论文摘要

猪是进行人类异种器官移植研究的理想动物,而研究异种器官移植需对早期胚胎进行遗传操作。和体内生产的胚胎相比,目前猪胚胎体外生产效率不高,因此急需优化胚胎体外生产的条件。成熟卵母细胞移核后激活是核移植的关键步骤之一,卵母细胞激活率的高低直接影响核移植的效率。当前核移植效率低下,其原因之一就是受体卵母细胞未被充分激活。本试验对影响猪卵母细胞体外成熟培养、孤雌激活、体外受精及克隆胚移植的因素进行了研究,以便确立胚胎体外生产的最佳条件。本文研究了季节变化对卵母细胞体外成熟、孤雌激活胚体外发育能力及体细胞克隆胚移植后体内发育能力的影响。比较不同季节平均每个卵巢获得的A级卵的数量及卵母细胞核成熟的比例,统计分析不同季节核移植胚胎发育能力的差异,我们发现在春季移植克隆胚胎无论妊娠还是出生率都高于夏季和冬季。这可能是因为夏季和冬季的温度过高或过低对运输和胚胎移植操作过程中的克隆胚胎影响较大,特别是我们移植的1-2细胞期克隆胚胎。研究了放线菌酮预处理对猪卵母细胞减数分裂进程和孤雌激活后原核形成的影响。结果表明:放线菌酮（CHX）预处理卵母细胞可有效抑制其生发泡破裂（CVBD）的发生,在解除抑制后减数分裂可完全恢复。培养44h诟,TCM199+CHX组卵母细胞的激活率较低,但是差异不显著（P＞0.05）。多次孤雌激活试验表明,去卵丘卵母细胞最佳电激活参数为120v/mm,40μs,1Dc。乙醇单独激活显著低于7.5μg/mL细胞松弛素B（CB）+10μg/mL cHX、7.5μg/mLCB+2Mm6-二甲氨基嘌呤（6-DMAP）或7.5μg/mECB+10μg/mL CHX+2mM6-DMAP联合激活组（P＜0.05）。其中7.5μg/mlCB+10μg/mL CHX+2mM 6-DMAP组卵母细胞激活后囊胚发育率最高。电激活前用乙醇预处理卵母细胞,电激活后与不同的化学激活剂联合处理,结果表明乙醇（Ethanol）+电脉冲（DC pulse）组卵母细胞的囊胚率显著低于Ethanol+DC pulse+CHX,Ethanol+DC pulse+6-DMAP,Ethanol+DC pulse+CHX+6-DMAP组（P＜0.05）,Ethanol+DC pulse+CHX+6-DMAP组显著高于其它各组（P＜0.05）。电激活单独处理组卵母细胞囊胚率显著低于电激活与化学激活联合处理组（P＜0.05）。其中DC pulse+CHX+6-DMAP组显著高于Dc pulse+CHX,DCpulse+6-DMAP组。卵母细胞在含CHX（10mg/mL）的NCSU-23中预处理10min获得的囊胚率最高（25%）,显著高于预处理0min、30min、40min组（12.3%、17.1%、4.9%,P＜0.05）。试验结果表明电激活前,用CHX预处理较短时间可提高体外成熟卵母细胞孤雌激活胚的发育能力。以解冻后活力为0.3左右的冷冻精液进行体外受精时,精子浓度以107为宜;0.25mL细管冷冻精液IVF的卵裂率显著低于鲜精,但是囊胚率差异不显著;多精入卵率随着共孵时间或精子浓度的增长而增加,精卵共孵6h的受精效果较理想;猪体外生产胚胎的发育速度与囊胚异常率存在关系,体外受精后发育两天的4-cell和8-cell胚胎囊胚率显著高于2-cell和＞8-cell的胚胎,与4-cell和8-cell胚胎发育形成的囊胚相比,来自于2-cell和＞8-cell胚胎的囊胚发育异常率较高。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 引言
• 第一部分 文献综述
• 一、猪卵母细胞体外成熟与孤雌激活的研究进展
• 1 卵母细胞体外成熟研究的意义和进展
• 2 卵母细胞体外成熟研究的进展
• 3 哺乳动物卵母细胞的生长和成熟
• 4 影响卵母细胞体外成熟的因素
• 4.1 卵巢卵母细胞本身质量
• 4.2 外界因素对体外成熟的影响
• 4.2.1 卵巢保存温度及时间
• 4.2.2 体外培养时温度、时间和气相环境
• 4.3 成熟培养液中不同添加物对体外成熟的影响
• 4.3.1 激素添加
• 4.3.2 卵泡液（pFF）的添加
• 4.3.3 其他添加物对体外成熟的影响
• 二、猪卵母细胞孤雌激活研究进展
• 1 卵母细胞的激活原理
• 2 卵母细胞的激活方法
• 2.1 电激活
• 2.2 化学激活
• 2.2.1 钙离子载体A23187和离子霉素（ionomycin）
• 2.2.2 乙醇激活
• 2.2.3 其它化学激活剂
• 2.2.4 联合激活
• 3 卵母细胞孤雌激活的核质变化
• 4 核移植中卵母细胞激活研究的意义
• 三、猪卵母细胞体外受精研究现状
• 1 体外受精研究概况
• 2 研究意义
• 3 猪体外受精存在的问题及原因
• 4 影响猪体外受精的因素
• 4.1 精子密度和受精时间对体外受精的影响
• 4.2 体外受精液
• 4.3 促进精子获能的物质
• 5 精子处理方法
• 6 培养条件对体外受精胚发育的影响
• 参考文献
• 第二部分 试验研究
• 第一章 猪卵母细胞体外成熟与孤雌激活
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要仪器与试剂
• 1.1.2 溶液的配制
• 1.2 方法
• 1.2.1 卵母细胞体外成熟
• 1.2.2 成熟培养后COCs上卵丘细胞的去除
• 1.2.3 卵母细胞成熟鉴定
• 1.2.4 卵母细胞孤雌激活
• 1.2.5 孤雌激活后胚胎培养
• 1.2.6 染色标本制作同
• 1.2.7 核相的评估
• 1.2.8 胚胎移植手术操作流程
• 1.3 数据处理
• 2 结果
• 2.1 季节对卵母细胞体外成熟及孤雌激活发育的影响
• 2.2 放线菌酮素（CHX）对卵母细胞减数分裂的影响
• 2.3 电激活参数的研究
• 2.4 乙醇激活
• 2.5 电激活与不同化学激活剂联合激活
• 2.6 胺环己酮对猪卵母细胞孤雌激活的影响
• 3 讨论
• 参考文献
• 第二章 猪卵母细胞体外受精研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 主要试剂
• 1.1.2 卵巢
• 1.1.3 主要仪器设备
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 卵母细胞的采集和体外成熟培养
• 1.2.2 卵母细胞的准备
• 1.2.3 精子的准备
• 1.2.3.1 鲜精
• 1.2.3.2 冻精冷冻和解冻
• 1.2.4 精卵共孵育
• 1.2.5 受精卵的培养
• 1.2.6 观察卵裂率和囊胚率
• 1.2.7 多精入卵观察
• 1.2.8 胚胎染色体分析
• 1.3 数据处理
• 2 结果
• 2.1 不同共孵时间的受精能力比较
• 2.2 精子受精前孵育时间对猪卵母细胞体外受精及进一步发育的影响
• 2.3 精卵共孵时精子密度对体外受精的影响
• 2.4 冻精和鲜精受精能力的比较
• 2.5 胚胎发育速度对猪体外受精胚发育的影响
• 2.6 发育速度对囊胚染色体异常的影响
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文结论
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录