CXCR4基因修饰骨髓间充质干细胞体外迁移实验

论文摘要

本文旨在构建一种高表达CXCR4的大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）,考察CXCR4对细胞定向迁移能力的影响。MSCs常用于心肌梗死后的心肌修复,研究表明损伤的心肌组织高表达SDF-1,而MSCs表面表达CXCR4,依靠配体与受体的亲和,使MSCs靶向迁移到梗塞部位,参与组织修复。尽管在体外培养过程中发现部分MSCs膜表面有CXCR4的表达,但表达水平低,并且绝大多数干细胞不表达CXCR4。所以本实验拟采用逆转录病毒转导CXCR4基因的方式,增加MSCs表面CXCR4的表达量,来加强细胞的迁移速度和数量。对提高MSCs治疗心肌坏死起到积极的效果。本文通过密度梯度离心法分离出大鼠的骨髓单核细胞,通过贴壁法建立MSCs的体外培养体系,并对所培养的细胞进行鉴定。免疫染色鉴定CD106、CD29、CD44都表达呈阳性,结果显示MSCs分离培养成功。论文运用基因工程学方法构建pMSCV-IRES-CXCR4-GFP和pMSCV-neor-CXCR4两种逆转录病毒载体。测序表明其所携带的CXCR4 cDNA与GeneBank公布的序列一致,定向构建的逆转录病毒载体连接方向和开放阅读框正确,证明载体构建成功。两种质粒用磷酸钙法转染293T包装病毒,并用制备好的病毒感染MSCs。通过免疫细胞染色及流式细胞仪（FCM）检测比较两种质粒的转导效率。结果表明pMSCV-neor-CXCR4修饰的MSCs中抗体染色后的CXCR4红色荧光表达量为19.8%,而pMSCV-IRES-CXCR4-GFP中表达量为44.8%,并进一步通过RT-PCR的方法从mRNA水平检测到CXCR4基因在MSCs中表达。因此,选取pMSCV-CXCR4-IRES-GFP进行后续实验。运用transwell检测转基因MSCs在不同浓度SDF-1诱导下的靶向迁移效率。Transwell实验结果显示,CXCR4基因修饰的MSCs,向SDF-1的迁移能力得到显著增强,浓度在50ng/mL时为最佳迁移浓度,加入CXCR4阻断型抗体AMD3100可有效抑制基因修饰细胞的迁移。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 心肌梗死的背景
• 1.2 心肌梗塞与干细胞的疗法
• 1.2.1 胚胎干细胞
• 1.2.2 成体干细胞
• 1.2.3 造血干细胞
• 1.2.4 内皮祖细胞
• 1.2.5 多能成体祖细胞
• 1.2.6 骨骼肌成肌细胞
• 1.2.7 心肌祖细胞
• 1.2.8 间充质细胞
• 1.3 骨髓干细胞的归巢及SDF-1/CXCR4轴在归巢中的作用
• 1.3.1 干细胞的归巢
• 1.3.2 SDF-1/CXCR4轴在骨髓干细胞迁移和归巢的作用
• 1.3.3 SDF-1/CXCR4轴在心肌梗死治疗中的应用
• 1.4 本论文研究的主要内容、目的及意义
• 1.4.1 本论文研究的目的及意义
• 1.4.2 本论文研究的主要内容
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 实验仪器
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要试剂的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 MSCs的培养与鉴定
• 2.2.2 CXCR4基因逆转录病毒表达载体的构建
• 2.2.3 CXCR4体外转染MSCs及转染后MSCs的表达检测
• 2.2.4 CXCR4/SDF-1轴的体外靶向性实验
• 3 结果与讨论
• 3.1 MSCs的鉴定
• 3.1.1 形态特征
• 3.1.2 MSCs的免疫染色鉴定结果
• 3.1.3 MSCs的生长动力学检测
• 3.1.4 MSCs的冻存与复苏
• 3.1.5 本节讨论
• 3.2 CXCR4逆转录病毒质粒的构建
• 3.2.1 逆转录病毒一的目的基因片断CXCR4的酶切及回收
• 3.2.2 载体质粒pMSCV-IRES-GFP的补平反应及回收
• 3.2.3 pMSCV-GFP与CXCR4的连接及双酶切鉴定
• 3.2.4 重组质粒pMSCV-CXCR4-IRES-GFP的PCR鉴定
• 3.2.5 重组质粒pMSCV-CXCR4-IRES-GFP的CXCR4基因片段测序
• 3.2.6 逆转录病毒二的目的基因片断CXCR4的酶切及回收
• 3.2.7 中间载体质粒pBlue-script的补平反应及回收
• 3.2.8 pBlue-script与和hCXCR4的连接及双酶切鉴定
• r的双酶切反应及回收'>3.2.9 载体质粒pMSCV-neo^r的双酶切反应及回收
• r与CXCR4的连接及双酶切鉴定'>3.2.10 pMSCV-neo^r与CXCR4的连接及双酶切鉴定
• r-CXCR4的PCR鉴定'>3.2.11 重组质粒pMSCV-neo^r-CXCR4的PCR鉴定
• r-CXCR4的CXCR4基因片段的测序'>3.2.12 重组质粒pMSCV-neo^r-CXCR4的CXCR4基因片段的测序
• 3.2.13 本节讨论
• 3.3 两种CXCR4基因质粒体外修饰MSCs及转导效率的比较
• 3.3.1 质粒的纯度及浓度检测
• 3.3.2 病毒的制备
• 3.3.3 逆转录病毒感染大鼠的MSCs并进行转导效率的比较
• 3.3.4 RT-PCR检测CXCR4基因修饰的MSCs表达
• 3.3.5 基因修饰的MSCs生长动力学检测
• 3.3.6 本节讨论
• 3.4 SDF-1对CXCR4的体外靶向作用
• 3.4.1 transwell细胞体外穿越试验
• 3.4.2 CXCR4阻断型抗体AMD3100对MSCs迁移的影响
• 3.4.3 无血清条件下SDF-1/CXCR4轴对MSCs凋亡的影响
• 3.4.4 本节讨论
• 4 结论
• 4.1 结论
• 4.2 论文创新点
• 5 展望
• 6 参考文献
• 7 攻读硕士学位期间发表论文情况
• 8 致谢