论文摘要
Kasai手术（portoenterostomy）是治疗胆道闭锁（biliary atresia, BA）的重要手段,它创伤较大,术后疼痛剧烈,一般都需要给患儿进行必要的术后镇痛。但是,肝脏功能受损的胆道闭锁患儿对药物的代谢可能会减慢。当他们接受吗啡静脉持续输注时,其血药浓度如果过高,则会导致他们在术后镇痛的过程中出现呼吸抑制,造成缺氧并危及生命。吗啡的代谢主要由葡萄糖醛酸转移酶（UGT）和肝血流量决定。目前有关肝脏疾病对吗啡代谢的研究多数以动物或者成年肝硬化病人为研究对象,暂时并无特别针对胆道闭锁小儿的研究,结果也并不明确。活性氧产物（reactive oxygen species, ROS）在胆汁淤积导致的肝损伤中发挥了重要的作用,它以导致脂质过氧化,诱导凋亡或者促进肿胀坏死的方式破坏肝细胞,而抗氧化剂褪黑激素可以抑制这种损伤,对肝细胞有保护作用。既然活性氧产物可能是胆汁淤积时导致肝细胞死亡的主要原因,那么它应该对胆道闭锁小儿的UGT酶和肝血流都有潜在的影响,并与胆道闭锁小儿对吗啡的代谢功能密切相关。本研究计划进行临床研究（回归分析）和动物实验（对照试验）,探讨胆道闭锁小儿吗啡的代谢,明确ROS是否,以及如何影响胆道闭锁小儿吗啡代谢的问题（工作流程见附页一）。第一部分胆道闭锁小儿对吗啡的代谢及其与活性氧产物的关系目的：了解胆道闭锁小儿对吗啡的代谢及其与ROS的相关性。方法：临床部分：计划纳入50例择期行Kasai手术的胆道闭锁以及20例（年龄≤3月）无肝病,择期行腹部或盆腔手术的小儿进行临床研究。术后均给予入选病人静脉持续输注吗啡48小时（8μg/kg/min）,开始输注24小时后采血,HPLC测定吗啡的血药浓度,计算吗啡清除率。胆道闭锁小儿还在术中取肝标本,Fenton法检测ROS浓度。用Curve Estimation过程回归分析吗啡稳态血药浓度和ROS的关系。动物部分：30只250-300g的雄性Wistar大鼠随机分为假手术组,BDL（结扎胆道）组以及BDL+褪黑激素（抗氧化剂）组。加用褪黑激素组大鼠腹腔注射褪黑激素500μg/kg/day。6天后腹腔注射吗啡5mg/kg,3小时后断头处死并采血,HPLC测定吗啡血药浓度。同时留取肝标本测定ROS浓度。结果：临床部分：34例胆道闭锁和16例对照组小儿术后取得血标本。测得吗啡的稳态血药浓度为5.8（4.5～16.4）ng/ml,对照组为6.1（3.2～10.9）ng/ml。清除率分别为22.6（8.1～29.4）ml/kg/min和21.8（12.6～42.1）ml/kg/min,（P>0.05）,两组基本相同。47例胆道闭锁小儿取得肝标本。吗啡的稳态血药浓度随ROS增高有下降的趋势,其中年龄60天以内的患儿,两者的关系符合负对数回归方程（Y=79.5-15.11nX,n=14,R2=0.577,P=0.001）。动物部分：假手术,BDL及BDL+褪黑激素组ROS浓度分别为5.9（4.4～12.9）,12.5（10.1～17.1）,8.1（5.6～9.2）U/mg蛋白（P=0.004）,胆道梗阻后ROS上升,褪黑激素使其回落。吗啡血药浓度差别不大,分别为4.6（2.4～17.2）,1.4（1.0～2.8）,8.6（1.0～20.8）ng/ml（P>0.05）。结论：胆道闭锁小儿对吗啡的代谢能力与非肝病患儿相近,不随肝脏ROS浓度的增加而下降。胆道梗阻大鼠肝脏ROS不影响其对吗啡的清除,进一步提示ROS不明显损害胆道闭锁小儿对吗啡的代谢。第二部分活性氧产物对胆道闭锁小儿UGT酶mRNA以及蛋白表达的影响目的：了解ROS对胆道闭锁小儿UGT酶mRNA和蛋白表达的影响方法：临床部分：用本研究第一部分中留取的47例胆道闭锁患儿的肝脏标本,以Real time PCR的方法检测其肝脏UGT酶的mRNA表达,Western blot方法检测UGT酶的蛋白表达,与第一部分中检测到的ROS浓度进行回归分析。动物部分：用本研究第一部分中30只大鼠的肝脏组织标本,以Real time PCR的方法分别测定假手术,BDL以及BDL+褪黑激素3组大鼠UGT酶的mRNA表达,以Western blot方法检测其蛋白表达,进行组间比较。结果：临床部分：47例胆道闭锁患儿肝组织UGT酶的mRNA表达量为7.88（4.59～13.49）。蛋白表达量为0.49（0.25～0.79）。UGT酶的mRNA和蛋白表达与ROS均有负对数回归关系,随ROS升高而降低,回归方程分别为Y=27.2-4.31nX,（R2=0.2,p=0.002）和Y=1.136-0.1581nX（R2=0.128,P=0.014）。动物部分：假手术,BDL及BDL+褪黑激素3组大鼠UGT酶的mRNA表达量分别为0.81（0.70～0.86）,0.28（0.22～0.29）以及0.43（0.35～0.68）,P=0.001。UGT蛋白表达量分别为0.39（0.16～0.59）,0.12（0.12～0.15）以及0.33（0.28～0.42）,P=0.001。胆道梗阻使大鼠UGT酶mRNA和蛋白表达下调,褪黑激素使其回升。结论：胆道闭锁小儿肝脏UGT酶的mRNA和蛋白表达均随肝脏ROS浓度增加而降低。胆道梗阻大鼠肝脏活性氧产物使UGT酶的mRNA和蛋白表达下调,进一步提示ROS可能使胆道闭锁小儿UGT酶的mRNA和蛋白表达下降。第三部分活性氧产物对胆道闭锁小儿肝血流的影响目的：了解胆道闭锁小儿肝血流的变化以及ROS对它的影响方法：临床部分：本研究第一部分入选的病人,对其中12例胆道闭锁和6例肾盂积水患儿,在术前用DCE MRI评估比较肝血流量的差异,并将胆道闭锁患儿肝组织ROS浓度与肝总血流量和肝动脉灌注指数（HPI,肝动脉血流占肝总血流量的百分比）进行回归分析。动物部分：从本研究第一部分中的假手术,BDL以及BDL+褪黑激素3组大鼠中,各随机选择5只在造模后第六天用DCE MRI评估比较肝血流量的差异。结果：临床部分：两组患儿的肝总血流量相似,胆道闭锁小儿为3.51（2.72-3.88）ml/min/100ml,肾盂积水患儿为3.15（2.66-4.42）ml/min/100ml, P>0.05。胆道闭锁小儿肝动脉灌注指数（HPI）高于肾盂积水小儿,前者为0.65（0.58-0.70）,后者为0.54（0.47-0.65）,P=0.04。HPI与活性氧产物浓度之间符合对数方程Y=0.245+0.1021nx（R2=0.58,P=0.004）,HPI随活性氧产物增加而升高。吗啡稳态血药浓度与HPI有倒数回归关系,随肝动脉血流量增加而降低,符合倒数回归方程Y=4.559/X-2.446（R2=0.519,P=0.001）。动物部分：胆道梗阻后大鼠肝血总流量增加,使用褪黑激素后下降。假手术,BDL及BDL+褪黑激素3组大鼠相对其肾脏的肝总血流量值分别为0.37±0.13,2.00±0.70以及0.61±0.14,P<0.05。结论：胆道闭锁小儿的肝总血流量不低于非肝病患儿小儿,但是肝动脉血流在肝总血流中所占比例明显增加。活性氧产物越多,这种趋势越明显。肝动脉血流促进吗啡代谢,稳态血药浓度随其增加而降低。胆道梗阻大鼠肝脏ROS使肝血流量增加,进一步提示ROS可能维持了胆道闭锁小儿的肝血流量。
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