鸡IL-18变构基因与新城疫病毒HN基因融合表达载体的构建及体外抗马立克病肿瘤细胞的研究

论文摘要

新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）是一种溶癌病毒,可在肿瘤细胞内增殖、抑制并裂解肿瘤细胞。研究发现,NDV的包膜糖蛋白血凝素-神经氨酸酶（hemagglutinin-neuraminidase,HN）基因是NDV抗肿瘤的功能性基因,是NDV抗肿瘤作用的重要分子基础。IL-18具有明显的抗肿瘤作用,在肿瘤治疗和肿瘤基因治疗方面具有潜在的应用前景。为探讨HN基因及IL-18基因融合后抗肿瘤作用及其机制,本研究分别构建了HN基因、ChMIL-18基因及HN基因和ChMIL-18基因融合后的重组表达载体pPICZαA-HN、pPICZαA-ChMIL18和pPICZαA-HN-ChMIL18,经诱导表达后,其目的蛋白均具生物学活性,进而以鸡马立克病肿瘤细胞系-MSB-1为体外研究对象,对MSB-1细胞的增殖抑制作用及其机制等方面进行了初步研究,结果表明,HN蛋白、HN-ChMIL18融合蛋白均可抑制肿瘤细胞生长,HN-ChMIL18融合蛋白对细胞抑制作用明显强与HN蛋白,其原因可能是ChMIL-18蛋白对HN蛋白致肿瘤细胞凋亡有增强作用,而ChMIL-18蛋白虽具有淋巴细胞增殖活性,但对肿瘤细胞无明显的抑制作用,其为进一步研究HN基因和ChMIL-18基因融合蛋白体内抗马立克肿瘤奠定了基础,具有重要的理论和实际意义。1目的基因的获得及生物信息学分析1.1 ChMIL-18目的基因的获得根据Genbank中鸡IL-18成熟蛋白基因序列设计一对特异性引物,利用RT-PCR技术,从外周血淋巴细胞中扩增到了鸡IL-18成熟蛋白基因全序列,将其克隆至pMD18-T载体并测序,对测序结果进行生物信息学分析,结果表明:序列全长为507bp,其理论分子量为19.5KD,等电点为6.36,无糖基化位点,具抗原性等。为提高具有生物活性的ChIL-18的表达量,应用反向长距离PCR定点突变技术对鸡IL-18成熟蛋白基因第28位和第37位的Arg密码子进行同义突变,将毕赤酵母中低频密码子CGA突变为高频密码子AGA,获得突变体pMD18-T-ChMIL18,将其转化至E.coli JM109中,抽提质粒,经酶切和PCR鉴定后,进行测序,测序结果与原ChIL18比对表明突变成功,获得了目的突变基因。1.2 HN基因的获得应用RT-PCR方法对NDV LaSota株HN基因进行了扩增与克隆,得到大小约为1.7Kb的LaSota株HN基因,与Genbank中登录的HN基因大小一致:扩增序列经PCR、酶切鉴定及序列测定证实与预计结果相符:用DNAStar及在线分析软件对HN基因的生物信息学进行分析,其结果为:HN基因共577个氨基酸,理论分子量为63.0KD,等电点为7.54,12个半胱氨酸残基,5个N-糖基化位点,与B1、Clone30、LaSota、JI1和HB92核苷酸同源性在98.8%-99.8%,氨基酸同源性分别为98.8%-99.5%。1.3 HN-ChMIL18融合基因的获得根据表达载体pPICZαA及克隆载体pBluescript SK+（pBS SK+）的多克隆位点,设计HN基因的引物（含柔性接头）,在两端分别引入KpnI和BamHI酶切位点,以及变构体MIL-18引物（含柔性接头）,在两端分别引入BamHI和NotI酶切位点。分别以pMD18-T-HN、pMD18-T-ChMIL18为模板扩增得到融合基因片段HNf和ChMIL-18f,并克隆至pMD18-T载体,构建了克隆载体pMD18-T-HNf、pMD18-T-ChMIL18f。重组质粒pMD18-T-HNf和pBS SK+分别用/KpnI/BamHI双酶切,片段回收产物按适当比例连接,转化E.coli JM109感受态细胞,重组质粒命名为pBS SK+-HN。然后,重组质粒pMD18-T-ChMIL18f和pBS SK+-HN分别用BamHI、NotI双酶切,回收产物按适当比例连接,转化E.coli JM109感受态细胞,重组质粒鉴定正确后命名为pBS SK+-HN-ChMIL18,经酶切、PCR鉴定及序列比对表明获得了目的基因HN-ChMIL18。2表达载体的构建、诱导表达及表达产物的活性检测2.1表达载体pPICZαA-ChMIL18的构建、诱导表达及表达产物的活性检测质粒pMD18-T-ChMIL18和pPICZαA分别用EcoRl、KpnI双酶切,电泳回收纯化ChMIL18和pPICZαA双酶切产物,按适当比例进行连接,转化到E.coli JM109感受态细胞中,鉴定结果表明获得了重组质粒pPICZαA-ChMIL18。将重组质粒pPICZαA-ChMIL18用SacI酶切线性化,电脉冲方法克隆至Pichia Pastoris（P.Pastoris）X-33感受态细胞中,经高抗性筛选、PCR鉴定结果表明pPICZαA-ChMIL18已整合入P.Pastoris X-33染色体中,用1%甲醇对其进行诱导表达,SDS-PAGE结果表明目的蛋白存在于上清中,分子量约为23KD,Western blot结果表明表达产物具良好的免疫原性,淋巴细胞转化试验结果表明ChMIL18具有促淋巴细胞增殖的活性。2.2表达载体pPICZαA—HN的构建、诱导表达及表达产物的活性检测质粒pPICZαA和重组质粒pMD18-T-HN分别用KpnI/NotI双酶切,电泳回收纯化HN和pPICZαA片段,按适当的比例进行连接,克隆至E.coli JM109感受态细胞中,经酶切及PCR鉴定,结果表明获得了重组质粒pPICZαA-HN。重组质粒pPICZαA-HN用SacI酶切线性化,电击转化入P.Pastoris X-33感受态细胞中,经高抗性筛选、PCR鉴定证明pPICZαA-HN已整合入X-33的染色体上,对其进行诱导表达,SDS-PAGE、Western-blot及血凝试验结果表明上清中有目的蛋白,其分子量约为97KD,且具良好的免疫原性和凝集红细胞的活性。2.3表达载体pPICZαA-HN-ChMIL18的构建、诱导表达及表达产物的活性检测质粒pBS SK+ -HN-ChMIL18和pPICZαA分别用KpnI/NotI双酶切,电泳回收HN-ChMIL18与pPICZαA双酶切产物并纯化,按适当比例进行连接,克隆至E.coliJM109感受态细胞,酶切及PCR鉴定结果表明获得了重组质粒pPICZαA-HN-ChMIL18。重组质粒pPICZαA-HN-ChMIL18用SacI酶切线性化后,电击转化入酵母菌X-33感受态细胞中,高抗性筛选和PCR鉴定结果表明pPICZαA-HN-ChMIL18已整合入X-33染色体上,对其进行诱导表达,SDS-PAGE、Western-blot结果表明目的蛋白为分泌性表达,分子量约为103KD,具良好的免疫原性,同时,淋巴细胞转化试验、血凝试验证明表达产物具有促进淋巴细胞增殖和凝集红细胞的活性。3体外抗马立克肿瘤细胞系MSB-1的初步研究以马立克氏病肿瘤细胞系-MSB-1为体外研究对象,分别将ChMIL-18蛋白、HN蛋白、HN-ChMIL18融合蛋白与MSB-1细胞共培养后,通过增殖抑制试验、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞仪等方法探讨其抑制机制,MTT结果表明HN蛋白、HN-ChMIL18融合蛋白对MsB-1细胞的增殖有抑制作用,并呈剂量相关性,而ChMIL-18蛋白无抑制作用;琼脂糖凝胶电泳分析发现,ChMIL-18蛋白、HN蛋白、HN-ChMIL18融合蛋白与MSB-1细胞共培养一段时间后,HN蛋白、HN-ChMIL18融合蛋白均出现DNA断裂现象;ChMIL-18蛋白、HN蛋白、HN-ChMIL18融合蛋白与MSB-1细胞共培养后,流式细胞仪检测发现HN蛋白、HN-ChMIL18融合蛋白均引起MSB-1细胞出现了凋亡,而且HN-ChMIL18融合蛋白引起的凋亡数量比HN蛋白多,而单独的ChMIL18不能引起MSB-1细胞凋亡。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词
• 第一部分 文献综述
• 第一章 MD防制研究进展
• 1 鸡马立克氏病疫苗研究进展
• 2 接种途径
• 3 抗病育种
• 4 生物安全性措施
• 第二章 鸡IL—18基因研究进展
• 1 不同动物IL-18的分子结构
• 2 IL-18的表达调控
• 3 IL-18受体
• 4 IL-18的生物学功能
• 5 IL-18的抗肿瘤细胞及其作用机制
• 第三章 NDV HN基因研究进展
• 1 NDV抗肿瘤机制
• 2 HN蛋白结构及其毒力基础
• 3 HN蛋白的抗肿瘤机制
• 研究目的意义
• 第二部分 实验研究
• 第四章 鸡IL-18成熟蛋白基因的克隆、序列分析及生物信息学分析
• 1 材料
• 1.1 试验动物
• 1.2 菌株与载体
• 1.3 主要试剂
• 1.4 试剂配制
• 1.5 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 引物的设计与合成
• 2.2 鸡体内IL-18的诱导
• 2.3 鸡外周血单个核细胞总RNA的提取
• 2.4 ChIL-18成熟蛋白基因的扩增及检测
• 2.5 目的基因的克隆
• 2.6 重组质粒的鉴定
• 2.7 目的基因的核苷酸序列分析
• 2.8 鸡IL-18成熟蛋白基因序列及推导蛋白质的生物信息学分析
• 3 结果
• 3.1 鸡IL-18成熟蛋白基因的RT-PCR扩增
• 3.2 重组质粒pMD18-T-ChIL18的鉴定
• 3.3 ChIL18的序列测定
• 3.4 ChIL-18成熟蛋白核苷酸、氨基酸序列同源性比对及进化分析
• 3.5 疏水性分析结果
• 3.6 跨膜区预测结果
• 3.7 抗原性
• 3.8 N-糖基化位点分析
• 3.9 磷酸化位点分析
• 3.10 二级结构预测结果
• 4 讨论
• 5 小结
• 第五章 鸡IL-18成熟蛋白基因的定点突变及序列分析
• 1 材料
• 1.1 菌株与质粒
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 引物设计
• 2.2 ChMIL-18基因中密码子的突变
• 2.3 变构基因克隆载体的构建
• 2.4 对测序结果进行生物信息学分析
• 3 结果
• 3.1 ChMIL-18变构基因的获得
• 3.2 变构基因克隆载体的构建及鉴定
• 3.3 重组质粒pMD18-T—ChMIL18的序列测定
• 4 讨论
• 5 小结
• 第六章 鸡IL-18成熟蛋白基因变构体毕赤酵母表达载体的构建及表达
• 1 材料
• 1.1 菌株与质粒
• 1.2 检测引物
• 1.3 血清
• 1.4 工具酶及主要试剂
• 1.5 培养基及试剂配制
• 1.6 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 质粒pPICZαA的大量提取及纯化
• 2.2 重组质粒pMD18-T-ChMIL18大量提取及纯化
• 2.3 质粒pPICZαA和重组质粒pMD18-T-ChMIL18的双酶切及双酶切产物的纯化
• 2.4 连接反应
• 2.5 连接产物原核宿主菌JM109感受态细胞的转化
• 2.6 重组质粒的鉴定
• 2.7 重组质粒pPICZαA-ChMIL18/pPICZαA大量提取及线性化
• 2.8 酵母菌X-33感受态细胞的制备
• 2.9 电脉冲转化毕赤酵母
• 2.10 高抗性阳性转化子的筛选
• 2.11 阳性转化子的筛选
• 2.12 重组毕赤酵母的诱导表达及检测
• 2.13 重组毕赤酵母表达产物的检测及Western blot分析
• 3 结果
• 3.1 重组质粒pPICZαA-ChMIL18的构建及鉴定
• 3.2 重组质粒pPICZαA-ChMIL18酵母菌X-33的转化及阳性转化子的筛选
• 3.3 重组鸡ChMIL-18的诱导表达、SDS-PAGE及Western blot分析
• 4 讨论
• 5 小结
• 第七章 NDV LaSota株HN基因的克隆及序列分析
• 1 材料
• 1.1 病毒和鸡胚
• 1.2 菌株和质粒
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 引物设计
• 2.2 NDV LaSota株RNA的提取
• 2.3 RT-PCR扩增NDV-HN基因片段
• 2.4 PCR-HN基因回收产物与pMD18-T连接
• 2.5 连接产物的转化
• 2.6 重组质粒pMD18-T-HN的鉴定
• 2.7 目的基因的核苷酸序列测定
• 2.8 HN基因序列分析及推导蛋白质的生物信息学分析
• 3 结果
• 3.1 RT-PCR扩增的HN基因片段
• 3.2 克隆载体pMD18-T-HN的鉴定
• 3.3 重组质粒pMD18-T-HN的序列测定
• 3.4 HN同源性比对及进化树分析
• 3.5 疏水性分析结果
• 3.6 抗原性分析
• 3.7 跨膜区预测结果
• 3.8 磷酸化位点分析
• 3.9 糖基化位点分析
• 3.10 HN二级结构预测结果
• 4 讨论
• 5 小结
• 第八章 HN基因毕赤酵母表达载体pPICZαA—HN的构建及表达
• 1 材料
• 1.1 菌株与质粒
• 1.2 检测引物
• 1.3 工具酶及主要试剂
• 1.4 培养基及试剂配制
• 1.5 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 重组质粒pMD18-T-HN的大量提取及纯化
• 2.2 质粒pPICZαA和重组质粒pMD18-T-HN的双酶切及酶切产物的纯化
• 2.3 连接反应
• 2.4 连接产物原核宿主菌JM109感受态细胞的转化
• 2.5 重组质粒的鉴定
• 2.6 重组质粒pPICZαA-HN/pPICZαA大景提取及线性化
• 2.7 酵母菌X-33感受态细胞的制备
• 2.8 电脉冲转化毕赤酵母
• 2.9 高抗性阳性转化子的筛选
• 2.10 阳性转化子的筛选
• 2.11 重组毕赤酵母的诱导表达及检测
• 2.12 重组毕赤酵母表达产物的检测及Western blot分析
• 3 结果
• 3.1 重组质粒pPICZαA-HN的构建及鉴定
• 3.2 重组质粒pPICZαA-HN酵母菌X-33的转化及阳性转化子的筛选
• 3.3 阳性转化子X-33/pPICZαA-HN的诱导表达、SDS-PAGE及Western blot分析
• 4 讨论
• 5 小结
• 第九章 鸡IL-18变构基因和HN基因融合毕赤酵母表达载体的构建及其表达
• 1 材料
• 1.1 质粒和菌株
• 1.2 主要试剂
• 1.3 培养基及试剂配制
• 1.4 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 引物设计
• 2.2 融合基因片段HN和ChMIL-18的获得
• 2.3 pBS SK-HN-ChMIL18克隆载体的构建
• 2.4 重组质粒pPICZαA-HN-ChMIL18的构建
• 2.5 重组质粒pPICZαA-HN-ChMIL18酵母菌X-33的转化
• 2.6 高抗性阳性转化子的筛选
• 2.7 阳性转化子的筛选
• 2.8 重组毕赤酵母的诱导表达检测和Western blot分析
• 3 结果
• 3.1 克隆载体pBS SK+-HN的鉴定
• 3.2 重组质粒pBS SK+-HN-ChMIL18鉴定
• 3.3 重组质粒pPICZαA-HN-ChMIL18的构建及鉴定
• 3.4 HN-ChMIL18基因的序列测定
• 3.5 重组质粒pPICZαA-HN-ChMIL18酵母菌X-33的转化及阳性转化子的筛选
• 3.6 重组X-33/pPICZαA-HN-ChMIL18的诱导表达、SDS-PAGE及Western blot分析
• 4 讨论
• 5 小结
• 第十章 ChMIL-18、HN及HN-ChMIL-18表达条件的优化、表达产物的纯化及生物活性检测
• 1 材料
• 1.1 菌种
• 1.2 主要试剂
• 1.3 培养基及Bradford法测定蛋白质含量所需试剂配制
• 1.4 主要仪器和设备
• 2 方法
• 2.1 毕赤酵母表达条件的优化
• 2.2 毕赤酵母的高效表达
• 2.3 毕赤酵母表达产物的纯化
• 2.4 Bradford法测定蛋白质含量
• 2.5 表达产物的活性检测
• 3 结果
• 3.1 毕赤酵母表达条件优化的结果
• 3.2 蛋白质含量测定结果
• 3.3 鸡淋巴细胞转化实验结果
• 3.4 血凝活性测定
• 4 讨论
• 5 小结
• 第十一章 ChMIL-18、HN及HN-ChMIL18融合蛋白协同抗MD肿瘤的研究
• 1 材料
• 1.1 样品
• 1.2 细胞
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 马立克肿瘤细胞系MSB—1的培养
• 2.2 细胞生长抑制试验
• 2.3 DNA琼脂糖凝胶电泳
• 2.4 流式细胞仪检测
• 3 结果
• 3.1 ChMIL-18、HN及HN-ChMIL18对MSB-1细胞的增殖抑制作用
• 3.2 DNA琼脂糖凝胶电泳分析
• 3.3 流式细胞仪结果
• 4 讨论
• 5 小结
• 第三部分 结论
• 第四部分 参考文献
• 第五部分 附录
• 附录一 SDS-PAGE主要溶液的配制
• 附录二 酵母及细胞培养常用试剂的配制
• 附录三 测序图
• 致谢
• 作者简介