论文摘要
证是中医辨证论治的核心,证本质的深入阐释已经历史性地成为实现中医药学现代化的重要契机和突破口。中医证候众多,其中气虚血瘀证较为多见,与多种疾病相联系。近年来对气虚血瘀证的研究存在明显的局限性,这样一个证不能简单用血瘀证和气虚证来概括、等同。人类基因组计划的完成和后基因组时代的到来为全面认识证实质提供了可能的突破口。但目前关于气虚血瘀深层次的的分子机理的阐释仅仅是对个别基因的检测,不能从整体揭示证的实质。“芪归药对”是配伍理论丰富,临床应用甚广,颇具代表性的药对之一。该药对依据气血配伍原则组成,因其既能自成一方,又可作为基础要对配伍组方,而备受历代医家重视。但迄今为止,关于“芪归药对”相使及其益气活血效应的分子生物学基础等科学问题未见报道。本课题拟采用传统气虚致瘀动物模型,通过对气虚致瘀发展过程中动态基因表达谱的差异分析和比较研究,揭示气虚血瘀证的动态演变过程及其规律的分子基础;通过对证相关基因（群）功能的调控研究,初步阐明“芪归药对”益气活血效应的分子机理;同时,从“以药测证”的认识论角度反证气虚致瘀分子基础发现的合理性和科学性。方法:1.采用饥饿、过劳和寒凉复合因素复制大鼠气虚血瘀模型。实验周期4周。2.观察气虚血瘀发展中模型动物表征变化。动态监测气虚血瘀模型大鼠5、14、28天时的血液流变性、T淋巴细胞转化、T细胞亚型计数、肾上腺重量和肾上腺指数。3.全基因组芯片研究对照组大鼠和模型组大鼠5、14、28天时外周血细胞基因表达谱的变化。采用Gene Onology、GenMAPP2.1软件对比分析实验各时相点免疫功能差异表达基因生物学功能和信号通路。4.将SD大鼠分为对照组、气虚血瘀模型组、“芪归药对”高、中、低剂量组和黄芪组,造模方法同前。各剂量药对组分别灌胃给予相当于生药24、12、6g/kg体重的黄芪当归（5:1）水煎液,黄芪组灌胃给予相当于生药20g/kg体重的黄芪水煎液。5.动态监测“芪归药对”、黄芪组对气虚血瘀大鼠表征、血液流变性、T淋巴细胞转化和T细胞亚型计数、肾上腺重量的影响。6.采用实时荧光定量PCR检测实验5、14、28天时,“芪归药对”、黄芪对气虚血瘀大鼠外周血细胞IL-1β、TNF-α、HSP-70、NF-κB、p38MAPK和JNK六种因子mRNA的表达。7.观察“芪归药对”、黄芪对气虚血瘀大鼠胸主动脉病理变化的影响。8.采用实时荧光定量PCR检测实验28天时,”芪归药对”、黄芪对气虚血瘀大鼠胸主动脉组织中IL-1β、TNF-α、HSP-70、NF-κB、p38MAPK和JNK mRNA表达的影响;采用western blotting检测“芪归药对”、黄芪对气虚血瘀大鼠胸主动脉组织中NF-κB/p65和p-c-jun蛋白表达的影响。结果:1.模型动物表征与气虚血瘀临床表现一致。2.模型组大鼠全血粘度高切、中切与对照组相比无显著差异,全血粘度低切、全血还原粘度升高,28天时与对照组比较非常显著的升高（P<0.01）,纤维蛋白原含量、血浆粘度升高,在14天、28天时与对照组相比明显增多（P<0.05或P<0.01）;模型组大鼠RBC计数、RBC压积和RBC刚性指数在实验进程中均无明显变化,RBC聚集指数在5天与对照组比较有显著性的升高（P<0.05）,28天时有非常显著的升高（P<0.01）;RBC电泳时间延长,在14天、28天时与对照组比较差异显著或非常显著（P<0.05或P<0.01）。3.模型组大鼠CD4+T细胞计数减少,28天时与对照组相比差异显著（P<0.05）;CD8+T、CD3+T细胞计数在5天时与对照组比较明显减少（P<0.05）, 14、28天时与对照组相比减少的更为显著（P<0.01）。4.模型组大鼠外周血T淋巴细胞3H-TdR掺入量下降,与对照组相比有非常显著的差异（P<0.01）。5.对照组大鼠肾上腺重量在实验中一直增加,模型组大鼠肾上腺重量与对照组相比在第5天时有显著升高（P<0.05）,14天时与正常组接近,28天显著低于正常组（P<0.05）。对照组大鼠肾上腺指数在实验中无明显改变,模型组大鼠肾上腺指数随造模时间延长显著或非常显著的增加（P<0.05或0.01）。与对照组比较非常显著的增加（P<0.01）。6.大鼠全基因组芯片结果显示差异表达基因生物学途径分类集中在细胞过程、代谢过程,生物调节;细胞组件分类主要集中在细胞组件、细胞器细胞器组件和大分子复合物;分子功能分类主要是结合分子、催化活性、酶调活性。实验14天时差异表达的基因数目最多。7.与免疫功能相关的差异表达基因共有212个,免疫功能差异表达基因主要与免疫应答相关,免疫应答差异表达基因参与众多免疫过程,如免疫效应过程、适应性免疫应答、体液免疫应答等。GenMAPP信号通路分析细胞因子和炎症反应通路变化最明显。8.与模型组比较,“芪归药对”高剂量组大鼠体重28天时非常显著的增加（P<0.01）;大鼠游泳时间延长（P<0.05）;与模型组比较28天时舌象评分非常显著的下降（P<0.01）;低切全血粘度、全血还原粘度、纤维蛋白原含量下降,与模型组比较28天时差异显著（P<0.05）;血浆粘度14天时开始非常显著的下降（P<0.01）;RBC聚集指数与一直显著下降（P<0.05）,RBC电泳时间缩短,5天、14天与模型组比较差异显著（P<0.05）,28天差异非常显著（P<0.01）;CD8+T细胞数量显著升高（P<0.05）;外周血T淋巴细胞3H-TdR掺入量非常显著或显著性升高（P<0.01或P<0.05）;肾上腺重量5天时非常显著的下降（P<0.01）。、大鼠体重、游泳时间、舌象评分与模型组比较均无明显差异。9.与模型组比较,黄芪组大鼠RBC电泳时间缩短,5天、28天与模型组比较差异显著（P<0.05）;外周血T淋巴细胞3H-TdR掺入量14和28天时显著增加（ P<0.05）。10.与模型组比较,“芪归药对”中、低剂量组大鼠体重、游泳时间、血液流变学、T细胞亚群计数、淋巴细胞转化和肾上腺重量均无显著差异。11.与对照组比较,模型组大鼠外周血细胞中IL-1β, HSP-70, NF-κB, p38MAPK和JNK mRNA表达较对照组显著升高（P<0.05或0.01）,TNF-αmRNA表达在5、14天时较对照组非常显著升高（P<0.01）。与模型组比较,“芪归药对”高剂量组IL-1β, JNKmRNA表达非常显著下降（P<0.01）;TNF-αmRNA表达在5、14天时非常显著降低（P<0.01）;NF-κBmRNA表达28天时非常显著下降（P<0.01）;HSP-70, p38MAPK mRNA表达在14、28天时非常显著下降（P<0.01）。黄芪组与模型组比较,IL-1β, JNKmRNA表达显著下降（P<0.05或0.01）;TNF-αmRNA表达在5、14天时下降（P<0.05或0.01）;HSP-70, NF-κBmRNA表达28天时非常显著下降（P<0.01）;p38MAPK mRNA表达在14、28天时显著下降（P<0.05）。与黄芪组比较,“芪归药对”高剂量组IL-1β, JNKmRNA表达14天时显著下降（P<0.05或0.01）。12.模型组动脉内皮细胞有脱落,内膜明显增厚,中膜结构紊乱,平滑肌层明显增生;“芪归药对”组动脉内膜增生较模型组明显减轻,趋于正常动脉,黄芪组动脉内膜增生较模型组减轻但不明显,可见少量内皮细胞脱落。13.气虚血瘀大鼠动脉组织中TNFα、IL1、NF-κB、p38MAPK和JNKmRNA的表达均显著升高,与对照组差异非常显著（P<0.01）, HSP-70 mRNA表达无变化。黄芪组、“芪归药对”组显著或非常显著降低TNFα、IL1、NF-κB、p38和JNKmRNA（P<0.05或0.01）的表达,对HSP-70 mRNA表达无影响。与黄芪组比较,“芪归药对”高剂量组IL-1和JNK mRNA表达显著降低（P<0.05或P<0.01）。14.模型组大鼠动脉组织中NF-κB/p65和p-c-jun蛋白表达非常显著的升高（P<0.01）;“芪归药对”高剂量组大鼠动脉组织中NF-κB/p65和p-c-jun蛋白表达减少,（P<0.01）;黄芪组大鼠动脉组织中NF-κB/p65和p-c-jun蛋白表达减少,与模型组相比差异显著（P<0.05）;“芪归药对”降低NF-κB/p65、p-c-jun蛋白表达的能力更强,与黄芪组比较差异非常显著或显著（P<0.01或P<0.05）。结论1.长期饥饿、过劳、寒凉导致大鼠气虚,现代医学表征为毛色枯槁、体重下降、运动能力减低;随后出现舌象紫黯、鼠尾绀凉以及粘（全血粘度低切、全血还原粘度、血浆粘度的升高）、凝（纤维蛋白原含量增加）、聚（红细胞电泳时间延长、红细胞聚集指数增加）的血液流变学特点。2.气虚血瘀证动态演变过程中始终存在以T细胞数量、T细胞转化能力以及HPA轴免疫调节功能异常为主的免疫功能失衡。3.气虚致瘀证发展过程中涉及不同的生物学功能。气虚血瘀证是功能基因群而非单一基因的异常表达。4.淋巴细胞、补体、细胞因子等众多的免疫功能基因参与了气虚致瘀证的发展、变化,共同调控了免疫系统功能。5.“芪归药对”有效改善气虚血瘀模型动物表征和粘、凝、聚的血流状态;明显促进T细胞和肾上腺功能。6.“芪归药对”通过抑制NF-κB、p38MAPK和JNK多条免疫应答信号转导通路,进而调节IL-1β, TNF-α等细胞因子的表达来防治气虚血瘀证。
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