犬血清IgG的纯化及其部分特性研究

论文摘要

随着养犬业的迅速发展,对犬病的诊断和控制尤显重要。犬血清中IgG水平的测定,已是临床免疫检验和体液免疫研究的常用指标。作为研究工具,制备针对免疫球蛋白的多克隆或单克隆抗体已成为免疫学研究领域的热点。制备多克隆或单克隆抗体的关键就是分离纯化出尽可能多的纯度较高的免疫球蛋白,为此本文对犬血清IgG的纯化进行了探讨,并制备了多克隆抗体,对IgG部分特性进行了初步分析。采用饱和硫酸铵盐析、SephadexG-200柱层析法从犬血清中获得IgG,经PAGE电泳、SDS-PAGE电泳和免疫电泳鉴定,纯化后的IgG达到了电泳纯。Folin-酚法测IgG浓度,绘制了纯化过程的洗脱曲线。纯化的犬血清IgG用于制备鼠抗犬血清IgG多克隆抗体。采用免疫双扩散法、间接ELISA法和Western Blot对鼠抗犬血清IgG多克隆抗体进行了鉴定,免疫双扩散法和间接ELISA法测得多抗的效价分别为1:16和1:128000,Western Blot显示出多抗与IgG的重链和轻链反应的两条特异性条带。建立了以纯化犬血清IgG为包被抗原的间接ELISA法,优化后得出以下最佳反应条件:抗原包被量为0.25ug/mL,阳性和阴性对照血清稀释度为1:2000,酶标抗体羊抗鼠IgG-HRP的稀释度为1:5000,底物最适作用时间在20min左右。对犬血清IgG的部分特性进行了分析:1、凝胶电泳分析变性还原条件下电泳（SDS-PAGE）结果表明,犬IgG重链和轻链分子量分别为58KD和27KD;变性非还原条件下电泳只有一条主要条带,分子量为170KD,与SDS-PAGE所测结果一致。2、木瓜蛋白酶酶解实验木瓜蛋白酶水解IgG得到29kD和27kD两个片断,WesternBlot分析其有很高的生物活性。3、Western Blot分析以鼠抗犬血清IgG多克隆抗体作为免疫印迹的探针,分析纯化犬IgG免疫原性和反应原性。Western Blot分辨力明显高于凝胶电泳,但杂条带明显增多,鼠抗血清可识别IgG、IgG重链和轻链,说明纯化IgG有良好的免疫原性和反应原性。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 目录
• 插图和附表清单
• 本文常用缩写词
• 文献综述
• 1 免疫球蛋白的命名及其研究历史
• 2 免疫球蛋白分子结构
• 2.1 免疫球蛋白的基本结构
• 2.2 免疫球蛋白功能区
• 2.2.1 可变区
• 2.2.2 恒定区
• 2.2.3 结构域
• 2.2.4 铰链区
• 2.3 免疫球蛋白的其他成分
• 2.4 免疫球蛋白的水解片段
• 3 类与型
• 4 免疫球蛋白的基因构成
• 5 免疫球蛋白的生物学特性
• 6 免疫球蛋白的生物合成与免疫应答一般规律
• 7 IgG的测定方法
• 8 IgG的提取与纯化
• 8.1 样品的粗提
• 8.2 IgG的纯化
• 9 抗IgG抗体的研究
• 9.1 抗IgG多克隆抗体的研究
• 9.2 抗IgG单克隆抗体的研究
• 正文:犬血清IgG的提纯及其部分特性分析
• 引言
• 1 材料和方法
• 1.1 实验动物
• 1.2 实验材料
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要器材
• 1.5 血清制备
• 1.6 犬血清免疫球蛋白IgG分离纯化
• 1.6.1 硫酸铵分步盐析法
• 1.6.2 凝胶过滤层析纯化IgG
• 1.7 犬血清免疫球蛋白IgG鉴定
• 1.7.1 Folin-酚法测蛋白质浓度
• 1.7.2 Sephadex G-200柱洗脱曲线的绘制与层析峰抗原性鉴定
• 1.7.3 蛋白质纯度鉴定
• 1.7.3.1 SDS-PAGE电泳测蛋白质纯度
• 1.7.3.2 非还原非变性PAGE测蛋白质纯度
• 1.7.3.3 免疫电泳检测蛋白纯度
• 1.8 鼠抗犬血清IgG多克隆抗体的制备
• 1.9 多克隆抗体的鉴定
• 1.9.1 免疫双扩散法
• 1.9.2 间接ELISA检测方法建立
• 1.9.2.1 间接ELISA反应步骤
• 1.9.2.2 ELISA抗原最适合包被浓度与阴性、阳性血清最佳稀释度的确定
• 1.9.2.3 酶标抗体HRP-羊抗鼠IgG最佳工作浓度的确定
• 1.9.2.4 封闭液的选择
• 1.9.2.5 底物液的作用时间
• 1.9.2.6 ELISA稳定性实验
• 1.9.2.7 鼠抗犬血清IgG多克隆抗体效价测定
• 1.9.3 Western-blotting 检测鼠抗犬血清gIG多克隆抗体特异性
• 1.10 犬血清IgG的部分特性分析
• 1.10.1 分子量的测定
• 1.10.1.1 SDS-PAGE测定
• 1.10.1.2 非还原SDS-PAGE测定
• 1.10.2 木瓜蛋白酶水解IgG、Western Blot分析水解片段生物活性
• 1.10.3 Western Blot分析犬IgG的免疫原性和反应原性
• 1.10.3.1 变性还原条件下Western-blot
• 1.10.3.2 变性非还原下Western-blot
• 2 结果与分析
• 2.1 犬血清Ig的纯化与鉴定
• 2.1.1 犬免疫球蛋白分离产物浓度测定
• 2.1.2 Sephadex G-200柱洗脱曲线的绘制
• 2.1.3 蛋白质纯度鉴定
• 2.1.3.1 SDS—PAGE电泳测蛋白质纯度
• 2.1.3.2 PAGE电泳测蛋白质纯度
• 2.1.3.3 免疫电泳检测层析蛋白纯度
• 2.2 多克隆抗体的鉴定
• 2.2.1 免疫双扩散法
• 2.2.2 间接ELISA法实验结果
• 2.2.2.1 抗原、抗体最适工作浓度的初步筛选
• 2.2.2.2 最适封闭液的筛选
• 2.2.2.3 酶标二抗最适工作浓度的筛选
• 2.2.2.4 底物最佳反应时间选择
• 2.2.2.5 间接ELISA法稳定性实验
• 2.2.2.6 鼠抗犬血清IgG多克隆抗体效价测定
• 2.2.3 Western Blotting鉴定多抗特异性
• 2.3 犬血清IgG的部分特性分析
• 2.3.1 分子量的测定
• 2.3.1.1 SDS-PAGE测定IgG分子量
• 2.3.1.2 非还原SDS-PAGE测定
• 2.3.2 木瓜蛋白酶水解IgG、Western Blot鉴定分析水解片段生物活性
• 2.3.2.1 木瓜蛋白酶水解IgG最适反应条件确定
• 2.3.2.2 Western Blot结果
• 2.3.3 Western Blot分析犬IgG的免疫原性和反应原性
• 2.3.3.1 变性还原条件下Western-blot
• 2.3.3.2 变性非还原下Western-blot
• 3 讨论
• 3.1 分离策略的选择
• 3.2 纯化蛋白质的检测
• 3.3 抗血清的制备
• 3.4 间接ELISA检测方法的建立
• 3.5 木瓜蛋白酶酶解实验
• 3.6 Western Blot分析犬IgG的免疫原性和反应原性
• 4 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 攻读硕士学位期间发表的论文
• 读硕期间所做的学术报告