酵母数量性状主效基因的定位分离及克隆

论文题目: 酵母数量性状主效基因的定位分离及克隆

论文类型: 博士论文

论文专业: 遗传学

作者: 胡小华

导师: 罗泽伟

关键词: 复杂性状,重复选择回交,定位,酿酒酵母,乙醇耐受性

文献来源: 复旦大学

发表年度: 2005

论文摘要: 解析复杂性状多基因的遗传结构(包括多基因系统中主效基因的定位识别，遗传效应及相互作用模式，表达调控网络性质等)，是功能基因组学研究中最具挑战性的领域之一。而目前复杂性状基因定位的现状是，成功克隆到主效基因的不足二十例。主要有两方面原因：现有的理论算法大多依赖于性状的遗传模式(加性，显性或上位性)，而实际常常是对性状的遗传机制研究又不深，往往导致作图的偏离；另外，应用于动植物及人类多基因定位的分离群体或家系材料几乎都不具备将目标基因锁定到小于1cM的DNA区域所要求的有效减数分裂量。累积更多的有效减数分裂量和改进QTL作图的统计方法是保证复杂性状高精度高解析率定位的必然要求。本文以酵母的乙醇耐受性为试验模型，创造性地采用重复选择回交(recurrent selection and backcross，RSB)策略，试图高精度高解析率地解析复杂性状的多基因遗传结构。首先通过表型筛选和定向选择获得了极端表型的菌株，其中高耐菌株的表型值为近17％，而敏感菌株的表型值则不大于1％；并且利用双列杂交的试验策略估算了酵母乙醇耐受性的狭义遗传力为55％，了解了该性状是以加性效应占主导的遗传模式。为了验证RSB的作图效率(mapping power)，比较了与区间作图(interval mapping，IM)和复合区间作图(composite intervalmapping，CIM)方法的QTL定位效果。其中通过IM只能大致确定主效基因的位置，不能明确框定QTL区间；而CIM却能把QTL区高效地缩小到3 cM的临界区间(critical interval)。然而，使用RSB策略，通过五个世代框定了三个QTL区域，其中有一个区域与IM和CIM确定的区间相同。但是CIM作图定位的临界区间与RSB锁定的区间却偏差了约7.4 cM的距离。在RSB锁定的区域中，很简单地就找到一个候选基因，名为ASG1。分别通过序列测定、单倍型分析、基因剔除、以及等位基因替换进一步确证了ASG1为酵母乙醇耐受性的一个主效基因。表达谱分析表明，表型变异并不是由ASG1的表达量差异引起的；并且序列比对的结果发现，两个亲本的编码区有较大的编码差异，蛋白结构上的差异可能是导致表型变异的主要原因。通过结构域预测，发现ASG1是一个典型的转录因子。这也在一定程度上印证了国际上的一种共识，即复杂表型变异主要是由调节变异引起的。本文应用RSB方法精细地解析了酵母乙醇耐受性的复杂遗传变异，通过与传统QTL定位方法的比较，RSB策略表现出高精度、高解析率和稳健的特点，这给复杂性状精细定位的实验研究提供了新的思路和方法；并将酵母的试验模型引进数量遗传学研究，使得许多基本的关键性理论假设可以直接通过试验验证成为可能；RSB方法在模式生物上的成功应用，必将为动植物育种及其重要经济性状基因的定位克隆提供参考和依据。

论文目录:

中文摘要

英文摘要

第一章 文献综述

1 表型变异的遗传结构

1.1 孟德尔性状

1.2 复杂性状

1.2.1 复杂性状复杂性的原因

1.2.2 复杂性状的遗传分析方法

1.2.3 复杂表型变异的分子机制

1.2.4 复杂性状基因鉴定的研究进展

1.2.5 遗传基因组学

2 酵母遗传耐受性

2.1 酵母模式生物的应用

2.2 酵母的乙醇耐性

2.2.1 酵母乙醇耐受性的生化机理

2.2.2 酵母乙醇耐受性的遗传学进展

3 研究目的和意义

参考文献

第二章 酵母乙醇耐受性极端表型菌株的选择及遗传学分析

前言

1 试剂与材料

1.1 试剂

1.2 溶液

1.3 仪器

1.4 材料

1.4.1 菌株

1.4.2 质粒

2 实验方法

2.1 酵母乙醇耐受性的表型测定

2.2 细菌感受态的制备

2.3 细菌转化

2.4 细菌质粒的抽提

2.5 酵母转化

2.6 酵母DNA的抽提

2.7 四分体孢子的分离

2.8 HO基因剔除

2.9 酵母菌株单倍体二倍化及接合型的转变

2.10 酵母乙醇耐受性极端敏感型菌株的选择

2.11 半双列杂交

3 结果和分析

3.1 酵母菌株的乙醇耐性筛选

3.2 HO基因剔除

3.3 极端敏感型菌株的选择

3.4 半双列杂交

4 结论和讨论

4.1 酵母的乙醇耐受性是一个复杂的数量性状

4.2 自然选择紧密地贯穿在极端敏感型菌株的人工选择之中

4.3 极端敏感型菌株的选择具有高效的遗传进度

第三章 酵母F_2单倍体分离群体的QTL作图

前言

1 试剂和材料

1.1 试剂

1.2 工具软件

1.3 材料

2 实验方法

2.1 F_2分离群体的构建

2.2 分离群体的表型测定

2.3 微卫星标记的搜索及基因分型

2.4 荧光标记引物的基因分型

2.5 SNP标记的设计

2.6 DNA片段的割胶回收

2.7 PCR产物纯化

2.8 DNA序列测定

2.9 全基因组的 QTL扫描

2.10 精细定位

3 结果和分析

3.1 F_2单倍体分离群体的构建及表型测定

3.2 酵母基因组微卫星标记的设计

3.3 酵母全基因组QTL扫描

3.4 PCR-RFLP的SNP检测

3.5 精细作图

4 结论和讨论

4.1 选择性基因分型方法是高效的检测QTL的策略

4.2 QTL精细定位到3cM的区间

4.3 微卫星标记是鉴定酵母分子水平变异的常用工具

第四章 基于RSB群体的复杂性状的高精度高解析率定位

前言

1 试剂和材料

1.1 试剂

1.2 材料

2 理论解释

2.1 RSB的理论依据

2.2 RSB与其它QTL定位方法的比较

3 试验方法

3.1 构建极端表型亲本的等基因的相反接合型菌株

3.2 RSB试验设计及实施

3.3 表型的测定

3.4 基因分型

4 结果和分析

4.1 RSB五个选择世代的试验结果

4.2 RSB5个体的全基因组扫描

4.3 IX号染色体QTL区的精细基因型

5 结论和讨论

5.1 RSB策略可以高解析率地定位复杂性状的基因

5.2 RSB对复杂性状的基因定位具有稳健性

5.3 RSB策略具有较广的适用范围

第五章 酵母乙醇耐受性主效候选基因的定位克隆

前言

1 试剂和材料

1.1 试剂

1.2 溶液

1.3 仪器

2 实验方法

2.1 ASG1的编码区和上游基因调控区的序列测定

2.2 遗传分析

2.3 基因剔除

2.4 ASG1的等位基因置换

2.4.1 长片断的PCR扩增

2.4.2 T载体克隆

2.4.3 连接反应

2.4.4 基因置换质粒的构建

2.4.5 酵母转化

2.5 ASG1表达水平的检测

2.5.1 RNA的抽提

2.5.2 Affymetrix芯片的表达谱实验

2.6 蛋白结构域的预测

3 结果和分析

3.1 两极端表型亲本的DNA序列的比对

3.2 遗传分析结果

3.3 基因剔除

3.4 等位基因替换的实验分析

3.4.1 替换质粒的构建

3.4.2 转化酵母

3.4.3 表型测定

3.5 转录水平的检测

3.6 ASG1 motif的预测

4 结论和讨论

4.1 ASG1是控制酵母乙醇耐受性的一个主效基因

4.2 调节变异是导致复杂性状表型变异的重要遗传机制

4.3 基因组的不稳定性是乙醇耐受性变异的可能原因

参考文献

致谢

毕业感怀

发布时间: 2007-06-27

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标签：复杂性状论文;  重复选择回交论文;  定位论文;  酿酒酵母论文;  乙醇耐受性论文;