白蛋白纳米粒的胞吞作用研究

论文摘要

研究背景纳米给药系统若要发挥疗效,不仅要在靶部位浓集,还需保证将药物递送到胞内的作用靶点。虽然避免调理素和脂蛋白的作用及被巨噬细胞吞噬是药物靶向的重要条件,但是如果纳米给药系统不能以合理的方式到达细胞内的靶部位,并且有效释放药物,同样不能发挥很好的疗效。靶向纳米颗粒到达靶组织/靶器官后可在胞外释放药物,使药物以游离方式入胞或携带药物直接进入细胞,在胞内靶点适时地释放药物。前一种传递方式的关键在于给药系统的释放药物特性,胞外药物释放行为决定了最终的药效发挥。而后者给药系统的入胞过程涉及入胞方式、胞内转运、药物的胞内释放、细胞外排等复杂的细胞处置过程,也是药剂学领域备受关注且极具挑战的研究内容。大多细胞主要以内吞的方式对外源性纳米粒子进行摄取,而内吞主要分为网格蛋白介导的内吞（clathrin-mediated endocytosis）、细胞膜穴样凹陷介导的内吞（caveolae-mediated endocytosis）、大胞饮和非网格蛋白-细胞膜穴样凹陷依赖的4种内吞。而几年来备受关注的细胞膜穴样凹陷介导的内吞是将载体递送至pH条件和生物条件缓和的小窝体（caveosome）内然后被转运到内质网、高尔基体和胞浆中,避免了经典的内体／溶酶体转运体系。以网格蛋白介导内吞最为常见。纳米颗粒入胞后进入内体,进一步与溶酶体融合,这对非溶酶体靶向的药物不利。微粒种类、表面电荷、物化性质等因素都会影响甚至改变细胞的内吞途径,改变纳米给药系统在胞内的分布和在溶酶体中的转运过程,从而影响胞内靶点处的药物浓度。同时,细胞内吞效率、细胞消除、胞内药物释放也受载体因素的影响。结合实验内容与预实验结果,我们将钙黄绿素作为水溶性小分子药物模型,制备了钙黄绿素白蛋白纳米粒,考察了纳米粒包裹对其细胞摄取及内化途径的影响。研究目的制备白蛋白纳米粒,并进一步研究其胞吞机理。研究方法1.制备方法与表征用去溶剂化和乳化凝聚法制备钙黄绿素白蛋白纳米粒,并确定最佳处方和工艺条件。去溶剂化：先将白蛋白加入含有药物的稀水溶液中使之溶解,再加入有机溶剂使白蛋白脱水凝聚收缩成团粒,最后用甲醛或戊二醛作为交联剂固化成载药纳米粒。乳化凝聚法：①乳化。将药物与白蛋白一起溶解或分散于水中作为水相,将其加入搅拌着的油相中使之称为w/o型乳液。②固化。可以采用加热固化或用化学交联剂使白蛋白之间发生交联反应而固化,常用甲醛或戊二醛为化学交联剂。③分离。将形成的纳米粒加入乙醚溶解油相,离心分离,即得。纳米粒胶体溶液在长期储存过程中粒子会发生聚集和沉降现象,并有部分药物游离出来。因此,将纳米粒制成冻干粉针以提高制剂的稳定性。用透射电镜对纳米粒的形状和表面形态进行考察,并用粒径分析仪对粒径分布进行统计。采用动态透析法做体外释放研究。稳定性实验：将最佳处方的钙黄绿素白蛋白纳米粒冻干制剂于冰箱中4℃密封保存,分别于3个月、6个月、9个月和12个月测定纳米粒的外观、再分散性,考察其长期稳定性。采用经典的MTT法检测白蛋白纳米粒的细胞毒性,注射用盐酸阿霉素为阳性对照组。1mg·mL-1的药物溶液与细胞孵育48h后,通过多功能酶标仪测定细胞活力考察calcein HSA-NPs的细胞毒性。2.纳米粒胞吞机理研究本文采用多功能酶标仪在λex=470nm,λem=509nm处检测不同时间点时的细胞裂解液的荧光强度,激光共聚焦显微镜和荧光显微镜观察细胞摄取、胞内分布。对于细胞摄取机制的考察,细胞以1×106个/孔接种至6孔板上,待完全贴壁生长24h后,弃去培养液换成含细胞内吞抑制剂叠氮钠（NaN3）,2-去氧葡萄糖（2DG）,氯丙嗪（CPZ）,非律平（Filipin）,细胞松弛素D,蔗糖（Sucrose）的培养液,与细胞孵育30min后加入1mg-mL-1载钙黄绿素的纳米粒,继续培养1h。然后以PBS洗涤,胰酶消化后收集细胞,PBS洗涤3次,流式细胞仪检测其平均荧光强度,透射电镜观察细胞摄取的超薄切片。最后我们用荧光显微镜观察Calcein HSA-NPs对细胞F-Actin蛋白的影响。研究结果1.制备方法与表征采用去溶剂化法制备钙黄绿素白蛋白纳米粒,最佳制备处方和工艺为：白蛋白溶液的浓度为1%,钙黄绿素溶液浓度为1mg-mL-1,加入缓冲液的pH值为9,搅拌速度为700rpm,固化时间为12h。离心转速为15000r-min-1,30min,纳米粒冻干后产品外观较好,色泽均匀,易于保存。遇水振摇片刻即分散均匀,光子相关光谱仪测得平均粒径为204.8nm,多聚分散度为0.164, zeta电位为-29.6mV。大部分粒子分布在100-300nm范围内。透射电镜观察纳米粒为圆球形,表面光滑。体外释放结果显示钙黄绿素白蛋白纳米粒有较好的缓释作用,96h时释放不到80%,而钙黄绿素溶液在10h左右释放完全。可以保证后续的细胞实验过程中药物不从或仅少量从纳米粒中释放,避免游离药物摄取而干扰实验结果。稳定性考察结果显示,白蛋白纳米粒在4℃冰箱密封保存1年外观、重分散性和粒径没有变化,因此该制剂在低温环境中稳定性良好。细胞毒性结果显示与空白对照组相比,白蛋白纳米粒和钙黄绿素白蛋白纳米粒对细胞的活力无影响,阿霉素溶液的细胞毒性较显著。纳米粒对HepG2、L02、 HUVEC、A549细胞生长没有影响。2.纳米粒胞吞机理研究细胞摄取半定量实验表明,细胞摄取的纳米粒荧光强度随孵育时间的延长而增加,4h细胞摄取calcein HSA-NPs最多。对于细胞摄取定性实验,发现纳米粒孵育时间在0.5h、1.5h,细胞中的绿色荧光信号很少,可以看出随孵育时间的延长,纳米粒越来越向细胞核紧密靠近,4h发现纳米粒成簇分布在细胞核周围,10h纳米粒在细胞核周围紧密分布。而HepG2、L02、HUVEC、A549对其摄取随时间的变化纳米粒在细胞核聚集明显。细胞消除实验,消除4h内,纳米粒一直在细胞核周围。本实验采用低温和能量代谢抑制剂2DG和NaN3研究钙黄绿素的胞内聚集情况。结果显示两种情况下,钙黄绿素摄取均显著低于对照组（P均<0.05）。表明calcein HSA-NPs是通过内吞方式入胞的。2DG/NaN3、CD、CPZ和Sucrose均能显著抑制L02对calcein HSA-NPs的摄取,其抑制率分别为68.59%、69.65%、71.73%、67.81%。Filipin对细胞的摄取无显著影响。纳米粒对细胞F-actin蛋白的影响,将细胞单层与白蛋白纳米粒共同孵育2h、4h后的扫描图,与对照组相比,荧光强度明显减弱,胞质的荧光已无法识别,并且F-actin蛋白大都解聚形成松散的圆环状结构。组成膜骨架的环绕在各个紧密连接的细胞周围的"F-actin环”的结构发生改变。研究结论用去溶剂化法将钙黄绿素作为水溶性小分子药物模型,制备的钙黄绿素白蛋白纳米粒粒径较小,形态圆整,大小较均匀。白蛋白纳米粒的胞吞作用呈现时间、浓度、温度依赖性,均为主动转运过程,其可以显著提高跨膜能力差的水溶性小分子钙黄绿素的入胞能力。Calcein HSA-NPs主要是经clathrin介导的内吞途径和大胞饮入胞的,内化后主要集中在溶酶体内。白蛋白纳米粒的作用使细胞F-actin蛋白大都解聚形成松散的圆环状结构,影响了细胞之间的紧密连接。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 第一章 前言
• 1 纳米粒给药系统的作用特点
• 2 纳米载体入胞的方式和转运过程
• 3 结语
• 参考文献
• 第二章 钙黄绿素白蛋白纳米粒的制备和表征
• 1 材料与仪器
• 2 实验方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 第三章 细胞对白蛋白纳米粒的摄取机理
• 1 材料与仪器
• 2 实验方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 全文小结
• 中英文缩略词表
• 研究生期间发表和撰写论文
• 致谢
• 统计学审稿证明