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油菜蜂蜜中黄酮定量、定性分析及指纹图谱初步建立

2020-12-11阅读(453)

油菜蜂蜜中黄酮定量、定性分析及指纹图谱初步建立

论文摘要

蜂蜜是一种营养丰富的食品和保健品,主要由蜜蜂采集植物蜜腺分泌的汁液酿成。其中包含的蜜源植物的次级代谢产物——黄酮类化合物被用来表征蜂蜜的地理、植物来源属性、鉴别真伪等方面的研究已经引起广泛关注。本论文选取油菜蜂蜜为原料,对油菜蜂蜜黄酮的提取、总量测定、分离、定性和定量分析、黄酮指纹图谱的建立以及与油菜蜂花粉所含黄酮间的内在联系等方面作了较系统的研究,主要研究内容和实验结果如下：1.在比较AlCl3法和Al（NO3）3法测定蜂蜜中黄酮含量结果后,选定AlCl3显色法测定蜂蜜黄酮提取液中总黄酮含量。该方法测定结果与HPLC法测定结果偏差只有0.063,优于Al（NO3）3显色法,Al（NO3）3显色法与HPLC法的结果偏差为1.006。2.通过对XAD-2、AB-8、DM-130、D3520、NKA-9和Polyamide这六种不同极性树脂的静态吸附、解吸以及动力学实验的考察,结合准一级动力学方程,粒内扩散模型以及吸附等温曲线,最终筛选出最佳的树脂为Amberlite XAD-2。其平衡吸附量是39.70±0.55mg/g；解吸率为98.87±0.52%；粒内扩散是Amberlite XAD-2树脂吸附蜂蜜中黄酮类化合物速度的主要控制因素；最佳的实验吸附温度为25℃。3.采用柱层析动态学吸附实验,确定了XAD-2树脂提取、分离蜂蜜黄酮的工艺条件：上样蜂蜜量与树脂量的比为1.2：1；上样液pH=2；90%的甲醇为洗脱溶剂,并采用3倍柱床体积的甲醇量,在此条件下,加标回收率为82.8%,因此该条件能够比较好的将蜂蜜中的黄酮分离、提取。4.蜂蜜黄酮的HPLC最优分析条件为：采用0.3%甲酸水溶液为流动相A,纯甲醇为流动相B,使用Waters Symmetry C18色谱柱,在柱温30℃,流速1mL/min条件下,以梯度洗脱的方式进行分析,7种黄酮标样达到基线分离,蜂蜜样品中15种黄酮物质被分离；且经方法学考察其精密度、稳定性、重复性的相对标准偏差都控制在5%内。5.采用HPLC-MS/MS对油菜蜂蜜中黄酮类化合物进行分离鉴定,通过对目标化合物的MS以及MS/MS碎片离子结构解析,并结合黄酮标品信息,共鉴定出23种酚类物质,包括5种酚酸,17种黄酮类化合物；其中,白杨黄酮（267nm,314nm；UV）,5,7-二羟基双氢黄酮（243nm,295nm；UV）,短叶松素（290nm；UV）,芹菜素（267nm,339nm; UV）,5,7-二甲氧基双氢黄酮（243nm,328nm；UV）,3’,4’,5,7-四羟基-6-甲氧基黄酮（256nm,355nm；UV）是第一次在油菜蜂蜜中鉴定出来的黄酮类物质,这为确定油菜蜂蜜黄酮标记物提供根据。6.以54个不同产地和批号的油菜蜂蜜为研究对象,进行定量分析和指纹图谱研究。54批油菜蜂蜜样品总黄酮含量范围为0.989～6.477mg/100g,相差很大；其中山奈酚和槲皮素的含量在已知黄酮类物质中所占比例较大。指纹图谱研究获得29个共有指纹峰,其中以25号峰作为参照峰（山奈酚）,经聚类分析和相似度分析,可将54批蜂蜜样品分为4类。其中,27号G049湖北随州样品不仅总黄酮含量最低,而且被单独分为一类,可能样品本身掺杂有其他物质。经主成分分析,也将54批样品分为四类,其中7号和12号样品各单独为一类。分析结果与聚类分析和相似度分析结果虽有差异,但是与聚类分析结果的匹配度可达到81.48%。随后运用HPLC分析标准蜜、市售蜂蜜和混合蜂蜜（25%标品蜜+75%市售蜜）,只发现10个共有峰,且市售蜂蜜和混合蜂蜜经与54个批次蜂蜜样品一起进行聚类和相似度分析时被单独分为一类,差异于标准品蜂蜜。7.通过二次旋转正交试验优化了超声波辅助提取油菜蜂花粉中黄酮类物质的工艺,得到油菜蜂花粉中黄酮类化合物的最佳提取条件：乙醇体积分分数76%、料液比1：30、超声时间33min,超声波温度51℃。理论最优提取条件下总黄酮得率为2.12%,实际黄酮类物质得率为1.89%（n=3）,实测得率达到理论预测值89.15%。8.油菜蜂花粉中黄酮类化合物提取酸解液,经HPLC-DAD以及HPLC/MS分析可能含有9种黄酮类苷元。可以确定的黄酮类物质依次是：槲皮素、山奈酚、异鼠李素和柚皮素。油菜蜂花粉与油菜蜂蜜中黄酮类物质进行对比中发现,两者之间有联系也有差异。如：两者间有共有的物质槲皮素、山奈酚和异鼠李素；除了这三种物质外,蜂蜜有的黄酮物质短叶松素、生松素等,油菜蜂花粉中没有；而蜂蜜花粉中含有的柚皮素,蜂蜜中却没有发现。可能是因为蜂花粉经过蜂蜜的采摘、酶解等一系列作用和过程后,黄酮类化合物发生了衍生作用从而生成了其他的物质。本课题的研究为油菜蜂蜜的鉴别真伪和追溯地理、种属来源提供了重要的理论依据和实践指导。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 文献综述
  • 1 我国蜂蜜在国内外市场面临的问题
  • 2 指纹图谱研究及在食品质量控制中的应用
  • 3 蜂蜜中黄酮类化合物的研究
  • 3.1 高效液相色谱法
  • 3.2 毛细管电泳法
  • 4 论文研究内容
  • 5 创新点
  • 第二章 蜂蜜中总黄酮测定方法的确定
  • 1 材料与方法
  • 1.1 实验材料
  • 1.1.1 实验原料与试剂
  • 1.1.2 仪器设备
  • 1.2 实验方法
  • 1.2.1 蜂蜜提取液的制备
  • 3显色法测定蜂蜜中的总黄酮含量'>1.2.2 AlCl3显色法测定蜂蜜中的总黄酮含量
  • 3）3显色法测定蜂蜜中的总黄酮含量'>1.2.3 Al（NO3）3显色法测定蜂蜜中的总黄酮含量
  • 1.2.4 HPLC法测定蜂蜜黄酮含量
  • 2 结果与分析
  • 3与Al（NO3）3显色法测定蜂蜜中总黄酮含量结果比较'>2.1 AlCl3与Al（NO3）3显色法测定蜂蜜中总黄酮含量结果比较
  • 2.2 HPLC法测定蜂蜜中总黄酮含量
  • 3 结论
  • 第三章 蜂蜜中黄酮类化合物分离方法的研究
  • 1 材料与方法
  • 1.1 实验材料
  • 1.1.1 实验原料与试剂
  • 1.1.2 仪器设备
  • 1.2 实验方法
  • 1.2.1 树脂的预处理与再生
  • 1.2.2 树脂的静态吸附、解吸实验研究
  • 1.2.3 吸附动力学
  • 1.2.4 最优树脂的吸附等温线
  • 1.2.5 统计分析
  • 1.2.6 XAD-2树脂富集分离黄酮条件优化
  • 2 结果与讨论
  • 2.1 树脂的静态吸附、解吸率
  • 2.2 树脂的吸附动力学
  • 2.3 Amberlite XAD-2树脂的吸附等温线
  • 2.4 XAD-2树脂分离蜂蜜中黄酮条件优化
  • 2.4.1 蜂蜜上样量与树脂量的比例选择
  • 2.4.2 上样液pH的选择
  • 2.4.3 洗脱溶剂的浓度选择
  • 2.4.4 洗脱体积的选择
  • 3 结论
  • 第四章 HPLC-PDA以及LC-MS/MS对蜂蜜黄酮的分离鉴定
  • 1 材料与方法
  • 1.1 实验材料
  • 1.1.1 实验原料与试剂
  • 1.1.2 仪器设备
  • 1.2 实验方法
  • 1.2.1 蜂蜜样品供试液的制备
  • 1.2.2 HPLC-UV分析
  • 1.2.3 HPLC色谱条件优化
  • 1.2.4 HPLC方法学考察
  • 1.2.5 HPLC-ESI-MS/MS分析
  • 2 结果与讨论
  • 2.1 HPLC色谱条件优化
  • 2.1.1 色谱柱的确定
  • 2.1.2 流动相的确定
  • 2.1.3 流速的确定
  • 2.2 HPLC方法学的考察
  • 2.2.1 黄酮标准品的线性关系、检出限
  • 2.2.2 稳定性、重复性实验
  • 2.2.3 精密度、加标回收率实验
  • 2.3 黄酮标准样品的HPLC/MS分析
  • 2.4 油菜蜂蜜样品中黄酮类物质的LC/MS解析
  • 3 结论
  • 第五章 油菜蜂蜜中指纹图谱的建立及鉴伪
  • 1 材料与方法
  • 1.1 实验材料
  • 1.1.1 实验原料
  • 1.1.2 主要试剂
  • 1.1.3 仪器设备
  • 1.2 研究方法
  • 1.2.1 蜂蜜黄酮供试样品的制备
  • 1.2.2 HPLC定量分析
  • 1.2.3 指纹图谱特征分析
  • 1.2.4 相似度分析
  • 1.2.5 聚类分析
  • 1.2.6 主成分分析
  • 1.2.7 蜂蜜黄酮指纹图谱在鉴伪中的初步应用
  • 2 结果与讨论
  • 2.1 样品中黄酮类化合物的含量
  • 2.2 样品黄酮类化合物HPLC指纹图谱的分析
  • 2.3 相似度分析
  • 2.4 聚类分析
  • 2.5 主成分分析
  • 2.6 初步鉴伪应用研究
  • 3 结论
  • 第六章 油菜蜂花粉中黄酮类化合物的提取、分离与鉴定
  • 1 材料与方法
  • 1.1 实验材料
  • 1.1.1 实验原料与试剂
  • 1.1.2 仪器设备
  • 1.2 实验方法
  • 1.2.1 油菜蜂花粉中黄酮类化合物提取得率计算
  • 1.2.2 超声波辅助提取蜂花粉中黄酮类物质
  • 1.2.3 二次旋转正交试验设计
  • 1.2.4 蜂花粉黄酮提取液制备供HPLC-MS-MS分析
  • 1.2.5 黄酮类物质的HPLC-MS分析
  • 2 结果与讨论
  • 2.1 单因素对提取蜂花粉中黄酮类物质含量的影响
  • 2.1.1 提取溶剂浓度对油菜蜂花粉中黄酮得率的影响
  • 2.1.2 料液比对油菜蜂花粉中黄酮得率的影响
  • 2.1.3 超声时间对油菜蜂花粉中黄酮得率的影响
  • 2.1.4 超声温度对油菜蜂花粉中黄酮得率的影响
  • 2.2 二次旋转正交试验结果
  • 2.2.1 响应面分析
  • 2.2.2 岭嵴寻优分析
  • 2.3 HPLC/MS/MS分析
  • 3 结论
  • 第七章 结论与展望
  • 参考文献
  • 研究生期间发表文章
  • 致谢

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