基于16S rDNA-RFLP技术对圈养成年大熊猫秋季肠道菌群多样性的研究

论文摘要

大熊猫是我国特有的珍稀濒危动物,是熊科家族中最为珍稀,也是受到最大生存威胁的哺乳动物之一。大熊猫趋于濒危的主要原因之一是疾病致死,以肠道疾病最为严重。胃肠道的正常菌群是指寄生在动物胃肠道内对机体无害反而有益的一类微生物群落。正常情况下它们的数量和比例处于动态平衡中,在机体的营养消化、免疫、抗毒素、抗癌症等生理活动中发挥着巨大的作用。如果正常菌群的数量和菌群结构发生了变化,就会引发一系列的肠道疾病,严重威胁着大熊猫的健康。为了探究圈养成年大熊猫在秋季的肠道菌群结构,本实验采用16S rDNA-RFLP技术对中国保护大熊猫研究中心-四川雅安碧峰峡基地的3只圈养成年大熊猫（共五个粪样：TT9、TT10、TT1、XM10、YM10）在秋季肠道菌群的多样性进行了研究。首先以细菌16S rDNA通用引物扩增粪样总细菌16S rDNA基因,构建16S rDNA克隆文库,然后利用内切酶Msp I和Hinf I进行限制性内切酶片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphi sma, RFLP）分析聚类,聚类结果再利用α多样性的测度分析RFLP结果。最后选取一部分优势菌群进行测序分析,构建进化树。研究结果表明：（1）经过构建克隆文库,RFLP聚类以后,TT9, TT10、TT11、XM10、YM10分别得到了57个、48个、30个、35个、52个OTUs,其文库的覆盖率分别为58.33%、67.31%、80.00%、71.88%、68.52%。说明所构建的文库具有很好的代表性。同时也表明大熊猫肠道内细菌具有丰富的多样性。（2）通过α多样性的测度分析RFLP结果显示,物种的丰度指数（E, dMa, R2）,均匀度指数（Jsw）、多样性指数（H’、Hmax、Dg）和Chao1物种多样性指数（Schaol）均说明,圈养大熊猫在秋季的肠道细菌多样性以9月份相对较高,而11月份较低。而在成年大熊猫之中,年龄偏小的肠道菌群多样性高于年龄偏大的。大熊猫生活的环境对肠道菌群的多样性也有一定的影响。（3）经过选取一部分优势菌群进行测序,在NCBI上BLAST以后,用DNAstar构建进化树可知,所测的优势菌群主要归属于3个细菌门：变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）.其中变形菌门主要以大肠埃希杆菌属（Escherichia）、假单胞菌属（Pseudomonas）、志贺氏菌属（Shigella）为主,厚壁菌门主要以链球菌属（Streptococcus）为主,而拟杆菌门主要以鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium）为主。（4）其中TT9的肠道菌群主要以Pseudomonas为主（36.11%of total clones）,其次为Escherichia（7.4%of total clones）,TT10主要以Escherichia为主（12.5%of total clones）, TT11主要以Escherichia和Shigella为主（均为21.0%oftotal clones）,其次为Streptococcus （12.4%of total clones）, XM10主要以Shigella为主（45.8%of total clones）,YM10主要以Escherichia为主（13.9%of total clones）,其次为Pseudomonas （8.3%of total clones）.

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 肠道微生物的概况
• 1.1 正常菌群的概念
• 1.2 胃肠道的正常菌群
• 1.3 肠道菌群的分类
• 1.4 肠道菌群的分布
• 1.5 肠道菌群的作用
• 1.5.1 营养与消化作用
• 1.5.2 免疫作用
• 1.5.3 屏障作用
• 1.5.4 抗肠毒的作用
• 1.5.5 抗肿瘤作用
• 1.5.6 其他生理作用
• 1.6 菌群失调的危害
• 2 大熊猫肠道微生物的研究进展
• 2.1 大熊猫的概况
• 2.2 大熊猫肠道微生物多样性研究现状
• 2.2.1 大熊猫肠道正常菌群的研究进展
• 2.2.2 大熊猫肠道致病菌的研究进展
• 2.2.3 大熊猫肠道优势菌群的研究
• 2.2.4 大熊猫肠道菌群多样性动态变化的研究
• 3 微生物菌群多样性分析方法的研究进展
• 3.1 传统的研究方法
• 3.1.1 平板分离法
• 3.1.2 Biolog微平板分析
• 3.1.3 磷脂脂肪酸图谱分析方法
• 3.2 现代分子生物学技术的研究方法
• 3.2.1 基于分子杂交技术的分子标记法
• 3.2.2 基于PCR技术的研究方法
• 4 本实验主要研究内容及目的
• 第二章 实验材料和方法
• 1 实验材料
• 1.1 实验的主要仪器
• 1.2 实验中的主要试剂及溶液的配制
• 1.2.1 实验中的主要试剂
• 1.2.2 实验中主要溶液的配制
• 1.3 PCR引物
• 1.4 数据分析软件
• 2 实验步骤
• 2.1 成年大熊猫粪便的采集
• 2.2 细菌的粗提取
• 2.3 粪便细菌总DNA的提取
• 2.4 粪便总DNA的检测
• 2.5 粪便总细菌16S rDNA片段PCR扩增的优化
• 2.6 粪便总细菌16SrDNA片段的PCR扩增
• 2.7 细菌16SrDNA扩增片段的纯化回收及检测
• 2.8 16S rDNA文库的构建
• 2.8.1 目的片段与T载体相连接
• 2.8.2 转化
• 2.8.3 阳性克隆子的筛选
• 2.8.4 对筛选出来的阳性克隆子进行酶切
• 2.9 RFLP聚类分析
• 2.10 对所构建的文库进行统计分析
• 2.10.1 覆盖率（Coverage,C）
• 2.10.2 物种的丰富度指数
• 2.10.3 物种均匀度指数
• 2.10.4 物种多样性指数
• 2.10.5 Chaol物种多样性指数（Schaol）
• 2.11 DNA序列的测定
• 2.12 16S rDNA的系统发育分析
• 第三章 实验结果与分析
• 1 粪便细菌总DNA的提取
• 2 细菌16S rDNA片段PCR扩增的优化
• 3 粪便总细菌16SrDNA片段的PCR扩增
• 4 细菌16SrDNA扩增片段的纯化回收及检测
• 5 16SrDNA文库的构建
• 5.1 目的片段的连接与转化
• 5.2 阳性克隆子的筛选结果
• 5.3 对筛选出来的阳性克隆子进行酶切
• 6 RFLP聚类分析
• 7 对所构建的文库进行统计分析
• 8 优势菌群序列的测定及比对
• 9 进化树的构建
• 9.1 变形菌门（Proteobacteria）
• 9.2 厚壁菌门（Firmicutes）
• 9.3 拟杆菌门（Bacteroidetes）
• 第四章 讨论
• 1 大熊猫肠道菌群研究方法的优缺点
• 2 对构建大熊猫肠道菌群16SrDNA文库的讨论
• 2.1 大熊猫粪便的处理
• 2.2 粪便细菌总DNA的提取
• 2.3 PCR条件的优化
• 2.4 16S rDNA数据的处理及分析的讨论
• 2.5 16S rDNA-RFLP数据的多样性分析
• 3 关于优势菌群的系统进化树讨论
• 第五章 结论与展望
• 1 结论
• 2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录