甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育基因与恢复基因的精细定位

论文摘要

Rs1046AB是派生于宜3A的纯合型甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育系,具有败育彻底、不育性稳定和恢复源广泛等特点。1985年,李树林等经过大量的遗传分析后,提出甘蓝型油菜显性核不育材料宜3A的育性受两对显性基因互作控制的遗传假说,其中一对为显性不育基因,另一对为显性上位抑制基因,当显性不育基因单独表达时可以导致雄性不育,而当显性上位抑制基因存在时,育性又可以恢复正常。最近宋来强等（2006）通过遗传分析表明利用一对复等位基因控制的模式来解释Rs1046AB的遗传更加合理,即Ms为显性不育基因,Mf为等位显性恢复基因,ms为正常可育位点,并且具有Mf＞Ms＞ms的显性遗传效应。以Rs1046AB为主要材料,洪登峰（2006）已利用一个192株的F2群体对Rs1046AB的不育基因和恢复基因进行了初步定位。以此为基础,本研究中通过不育系Rs1046A和恢复系195-14A（温敏型细胞质雄性不育两用系）杂交构建F2:3家系和F2全不育株群体,利用分子标记技术筛选与不育基因Ms和恢复基因Mf连锁的分子标记,进一步开展显性核不育基因与恢复基因（Ms/Mf）的精细定位研究,取得的主要结果和结论如下:1.将3个AFLP标记E3M10、E1M13和S5T5（洪登峰,2006）成功转化为SCAR标记（依次命名为:SCD2、SCD7和SCD8）。,并结合SCAR标记SCE3（陆光远,2003）和SCHDF（洪登峰,2006）,进一步分析708个单株构成的F2:3家系和987个单株的F2全不育株群体,结果表明:SCD2、SCE3、SCD7和SCD8 4个SCAR标记全部位于目标基因一侧,距目标基因（Ms/Mf）的遗传距离依次为2.0cM、1.7cM、1.5cM、0.1cM,另外一个SCAR标记SCHDF位于目标基因的另一侧,且距目标基因的遗传距离为2.3cM,实现了对目标基因的准确定位。2.应用BSA法,结合AFLP技术,继续筛选了512对AFLP的引物组合,获得了4个与目标基因紧密连锁的AFLP标记。其中2个标记（P1M1、P1M4）为共显性标记,被定位于SCAR标记SCD7与SCD8之间。另外2个标记（P3M2、P12M6）为显性标记,与恢复基因连锁,分别位于目标基因两侧,前者被定位于SCAR标记SCD7和SCD8之间,后者被定位于标记SCHDF与目标基因之间,使目标基因的遗传距离进一步缩小。3.通过比较测序,将Song et al.,（2006）在甘蓝型油菜显性核不育系609AB中获得的不育基因两侧最近的SCAR标记SC6和SC9进行整合,并成功转化为既与不育基因连锁又与恢复基因连锁的SCAR标记,重新被命名为SC6D和SC9H。前者被定位于AFLP标记P12M6与目标基因之间,后者被定位于AFLP标记P3M2和P1M1/P1M4之间,且分别距目标基因的遗传距离均为1.0cM。结合上述AFLP标记和SCAR标记,在本研究中实现了对目标基因（Ms/Mf）的精细遗传定位。4.利用DH群体TN（Tapidor×Ningyou7）的遗传图谱将目标基因Ms/Mf定位于甘蓝型油菜的N8连锁群,并在N8连锁群上成功开发出一个与Ms/Mf基因连锁的共显性SSR标记HUA348,实现了目标基因精细定位图谱与已公布的甘蓝型油菜图谱的整合。5.根据目标基因区段与对应拟南芥同源区的信息（洪登峰,2006）,在目标基因两侧标记之间,设计18对特异引物（DFN1-DFN18）对目标区段进行扩增,结果除了DFN03、DFN12、DNA14和DFN18等4对引物外,其余14对引物都同时扩增出不育基因和恢复基因,对这14对引物进行比较测序分析之后再次设计引物,结果仍然没有开发出新的分子标记。6.以与目标基因紧密连锁的SCAR标记SCD8为探针进行Southern杂交,筛选甘蓝型油菜Tapidor BAC文库,获得了29个具有强杂交信号的BAC克隆。7.利用DFN1、DFN5、DFN8、DFN16和SCD8共5对引物通过PCR分析的方法对所获得的29个BAC克隆进行阳性验证,结果依据其中的18个克隆形成了可能覆盖Ms/Mf基因的BAC克隆重叠群。利用限制性内切核酸酶HindⅢ完全酶切29个BAC克隆,构建其指纹图谱,进一步验证了利用PCR分析法构建的BAC克隆重叠群。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1.文献综述
• 1.1 雄性不育与油菜杂种优势利用
• 1.1.1 细胞质雄性不育
• 1.1.2 细胞核雄性不育
• 1.2 油菜显性细胞核雄性不育的研究
• 1.2.1 显性细胞核雄性不育的遗传
• 1.2.2 显性细胞核雄性不育的细胞学研究
• 1.2.3 显性细胞核雄性不育的分子机理研究
• 1.2.4 显性细胞核雄性不育的应用研究
• 1.3 芸薹属及其他作物中显性细胞核雄性不育的研究
• 1.4 分子标记及其在作物遗传改良中的应用
• 1.4.1 分子标记的类型
• 1.4.2 分子标记的开发
• 1.4.3 几种新型的分子标记
• 1.5 图位克隆的技术步聚
• 1.5.1 筛选与目标基因连锁的分子标记
• 1.5.2 目标基因区域的精细作图
• 1.5.3 目标基因区段物理图谱的构建
• 1.5.4 基因克隆
• 1.6 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 群体构建
• 2.3 样品采集与DNA提取
• 2.4 单株育性调查
• 2.5 BSA与AFLP分析
• 2.5.1 DNA混合池的构建
• 2.5.2 AFLP分析
• 2.6 AFLP标记的克隆与SCAR标记的转化
• 2.6.1 差异片段的回收与再扩增
• 2.6.2 连接反应
• 2.6.3 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
• 2.6.4 重组子筛选、鉴定及测序
• 2.6.6 SCAR标记的直接转化
• 2.7 分子标记的开发
• 2.7.1 通过比较测序开发分子标记
• 2.7.2 通过图谱定位开发分子标记
• 2.7.3 根据拟南芥同源区段开发分子标记
• 2.8 多重PCR技术
• 2.9 遗传连锁分析与遗传图谱的绘制
• 2.10 BAC文库的筛选
• 2.10.1 探针的制备
• 2.10.2 Southern杂交
• 2.10.3 杂交信号的读取
• 2.10.4 BAC克隆的阳性验证
• 2.11 BAC克隆重叠群的构建
• 2.11.1 细菌质粒DNA的提取
• 2.11.2 重叠群的构建
• 3.结果与分析
• 3.1 定位群体单株的育性调查结果
• 3.2 AFLP标记差异片段的回收、测序和SCAR转化
• 3.3 SCAR标记在大群体中的检测分析
• 2群体的检测'>3.3.1 F₂群体的检测
• 3家系的检测'>3.3.2 部分F₃家系的检测
• 3.3.3 全不育株群体的检测
• 3.4 AFLP标记的筛选
• 3.4.1 与Ms/Mf基因连锁的AFLP标记
• 3.4.3 与Ms/Mf基因连锁标记的交换单株分析
• 3.5 分子标记的开发
• 3.5.1 利用比较测序技术开发新的分子标记
• 3.5.2 基于拟南芥同源序列比较的分子标记
• 3.5.3 交换单株的分析
• 3.6 Ms/Mf基因的精细遗传图谱的构建
• 3.7 Ms/Mf基因的图谱定位
• 3.8 Ms/Mf基因的物理定位
• 3.8.1 Tapidor BAC文库筛选
• 3.8.2 覆盖Ms/Mf基因区段物理图谱的构建
• 3.8.3 限制性酶切指纹图谱的构建
• 4 讨论
• 4.1 精细定位群体的选择
• 4.2 分子标记与目标基因的精细定位
• 4.3 分子标记的开发途径
• 4.4 与Ms/Mf紧密连锁分子标记的应用价值
• 4.5 Southern杂交结合PCR法进行物理作图的可行性分析
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 附录3
• 作者简介
• 致谢