生殖细胞特异蛋白GGN1/GGN3与二噁英诱导表达蛋白GGNBP2的相互作用

论文摘要

FANCL（也被称作PHF9、POG）是一种新近被发现,具有PHD结构域的E3泛素连接酶（ubiquitin E3 ligase）。现有的研究表明它至少在两项生理过程中发挥作用,一个是与生殖细胞的发生有关,它在胚胎期原初生殖细胞（primordial germ cells, PGCs）增殖过程和成年期睾丸的生精过程（spermatogenisis）中发挥重要的作用,在小鼠中,这个基因突变的纯合体会表现出生殖细胞缺陷症（gcd）的性状;另一个则与人的范康尼氏贫血症（Fanconi animia）的发病有关,它作为一个催化亚基与范康尼氏贫血症核心复合物（Fanconi animia core complex）一起使得FANCD2单素化,单泛素化后的FANCD2将与BCRCA1、BCRCA2形成复合物参与DNA的修复过程[1][6]。在寻找与FANCL相互作用的蛋白时,筛选出了两种新蛋白编码基因Ggn1和Ggn3,它们是由生殖系统特异表达基因Ggn转录的mRNA前体通过不同的剪接方式形成的,两种蛋白均可以与FANCL相互作用[4]。在进一步寻找Ggn基因的功能时,同样使用了酵母双杂交技术寻找与GGN1相互作用的蛋白,最终我们获得三个与其相互作用的蛋白,其中之一为GGNBP2（又被称作DIF-3和ZFP403）,是一种功能未知蛋白,它在成年小鼠睾丸中表达并且可在胚胎干细胞中被TCDD（2,3,7,8-四氯二苯并-对-二噁英）诱导表达。 本实验工作主要集中于GGN1与GGNBP2相互的作用进一步确认以及功能未知蛋白GGNBP2部分性质的研究,主要内容及结果如下: 1.由于实验的需要,我们还原核表达了GGN1和GGNBP2的蛋白片段,作为抗原免疫家兔制备了GGN1和GGNBP2的抗血清,同时制备和使用了特异的抗原亲合柱对他们进行了纯化,利用组织干粉吸附法进一步提高其特异性。 2.由于当前还没有建立一种可以体外培养的生殖细胞系,所以为了以后研究的方便,又筛选建立了可以稳定表达EGFP/GGN1融合蛋白的CHO细胞株。 3.对GGNBP2的表达性质（包括亚细胞定位、组织分布、表达时相、mRNA剪接方式以及蛋白分子量大小）进行了研究。 4.通过酵母共转化、细胞共定位、免疫共沉淀等技术,逐步确定了GGN1与GGNBP2在酵母、体外培养细胞HEK293以及睾丸组织内的相互作用。 通过以上实验,我们相信将提高我们对生殖细胞发育相关的多个基因及FANC L在生殖系统中作用的认识。

论文目录

• 摘要
• Abstraet
• 第一章 前言
• 1 文献综述
• 1.1 生殖细胞的发育过程
• 1.2 Fanc L基因的研究背景
• 1.3 Ggn基因的研究背景
• 1.4 GGNBP2基因的研究背景
• 1.5 TCDD作用的分子生物学机制
• 1.6 蛋白质相互作用研究方法及原理
• 1.6.1 酵母双杂交技术（yeast two-hybrid system）
• 1.6.2 噬菌体表面展示技术
• 1.6.3 哺乳动物细胞双杂交
• 1.6.4 细胞免疫荧光共定位技术
• 1.6.5 GST-pull down技术
• 1.6.6 免疫共沉淀技术
• 1.6.7 间接检测方法
• 2 研究背景及目的
• 第二章 GGNBP2多克隆抗体的制备、纯化及其检测
• 1 实验材料、器材与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验仪器
• 1.3 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 GGNBP2的原核表达质粒的构建
• 2.2 GGNBP2的原核表达[表达产物命名为 His-GGNBP2（NP）
• 2.3 免疫家兔获得抗血清
• 2.4 对pPROEX-HTa/GGNBP2（NP）表达洗涤后包含体进一步纯化
• 2.5 制备 His-GGNBP2（NP）抗原亲和柱，从 His-GGNBP2（NP）兔多抗血清中纯化 GGNBP2相应抗体
• 2.6 纯化后 GGNBP2多抗的质量检测
• 3 讨论
• 第三章 GGN1/GGN3多克隆抗体的制备、纯化及其检测
• 1 实验材料、器材与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验仪器
• 1.3 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 GGN3的原核表达质粒
• 2.2 PGEX-4T1/GGN3的原核表达（表达产物命名为 GST-GGN3）
• 2.3 免疫家兔获得抗血清
• 2.4 pPROEX-HTa/ GGN3的原核表达（表达产物命名为 His-GGN3）
• 2.5 使用镍离子螯和柱对 His-GGN3包含体直接纯化
• 2.6 制备 His-GGN3抗原亲和柱，从 His-GGN3兔多抗血清中纯化 GGN1/GGN3相应抗体
• 2.7 纯化后 GGN3/GGN1多抗的质量检测
• 3 讨论
• 第四章 pEGFP-N2/GGN1稳定表达 CHO细胞系的建立
• 1 实验材料、器材与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验仪器
• 1.3 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 EGFP荧光显示筛选获得了较纯的GGN1稳定表达 CHO细胞系
• 2.2 WB确定 EGFP/GGN1融合蛋白在筛选细胞内的正确表达
• 3 讨论
• 第五章 GGNBP2基因的表达及其蛋白产物性质的初探
• 1 实验材料、器材与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验仪器
• 1.3 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 GGNBP2蛋白质产物在细胞内的定位
• 2.2 Northern Blotting分析 GGNBP2在不同组织中的表达
• 2.3 RT-PCR鉴定 GGNBP2在不同组织中存在不同的剪接方式
• 2.4 Northern Blotting分析 GGNBPZ在不同时期睾丸中的表达
• 2.5 GGNBP2及 GGN1蛋白可能存在未知的修饰方式
• 3 讨论
• 第六章 GGN1/GGN3与GGNBP2的相互作用
• 1 实验材料、器材与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验仪器
• 1.3 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 酵母共转化证明GGN1/GGN3与GGNBP2的相互作用及其相互作用区域
• 2.2 细胞共定位证明GGN1/GGN3与 GGNBP2的相互作用
• 2.3 免疫共沉淀证明GGN1/GGN3与GGNBP2的相互作用
• 2.4 免疫共沉淀证明睾丸组织内GGN1与 GGNBP2的相互作用
• 3 讨论
• 总结
• 参考文献
• 附录（一）实验构建质粒
• 附录（二）主要试剂溶液的配置
• 附录（三）使用引物及合成 DNA片段
• 附录（四）实验方法总结
• 发表相关学术论文
• 致谢