论文摘要
MicroRNA（miRNA）是一类隶属于非编码RNA （non-coding RNA）大家族并可在转录后水平调控基因表达的重要小分子,长度为21～23个核苷酸,可以通过诱发mRNA降解或抑制蛋白翻译的方式负调控靶基因。到目前为止,在人类基因组中已经确定的miRNA有650个以上,它们参与调控人类30%的蛋白表达。miRNA分子参与了包括发育、细胞分化、细胞凋亡、代谢和癌症等多种生理病理过程。基于miRNA的重要功能,近年来对miRNA的功能研究已成为科学研究的热点之一在miRNA的生物合成过程中,Drosha酶起到了非常重要的作用,它是RNaselll家族的成员,介导从pri-miRNA到-70nt pre-miRNA的加工过程。Drosha基因突变后,将会影响miRNA的正常生物合成,因此,建立Drosha基因突变细胞模型,有助于研究一些miRNA的生物学功能。本课题第一部分利用RNAi实验方法构建了293-siDrosha稳定细胞系,并探讨该稳定细胞系在miRNAs功能研究中的应用。具体研究如下：（1）将质粒pSicoR-human Drosha1转入人胚肾293细胞,用G418筛选2-3周后,获得293-siDrosha#3稳定细胞系。（2）用RT-PCR、Western blotting、real-time PCR等方法检测293-siDrosha#3稳定细胞系中Drosha基因mRNA和蛋白质表达情况。（3）用poly（A）实时定量RT-PCR方法检测野生型293细胞,Mix细胞（未克隆的293-siDrosha细胞）,293-siDrosha#3细胞（克隆的293-siDrosha细胞）中内源hsa-miR-491-5p的表达情况。本实验结果表明：（1）构建的293-siDrosha#3稳定细胞系与对照组相比,293-siDrosha#3细胞中Drosha基因的mRNA和蛋白质表达水平均显著下降。（2）通过检测内源性hsa-miR-491-5p在对照组和293-siDrosha#3细胞中表达情况,表明对照组细胞中表达的hsa-miR-491-5p是293-siDrosha#3细胞的近120倍。本实验成功构建了293-siDrosha稳定细胞系,并且证明此稳定细胞系可以作为研究一些microRNAs相关功能的模式细胞系。因为miRNA可以调控人类的生长发育、生理、病理状态,因此体液中广泛存在的miRNA可能作为研究人类生理和疾病状态的新的有效生物标志物。已经有研究表明在正常组织与病理组织中miRNA表达水平存在差异,即使是同一组织不同的分化时期,miRNA表达水平也不相同。这种差异表达也发生在肿瘤特异性miRNA上,从而帮助诊断肿瘤的组织来源和特定的肿瘤分型。研究表明miRNA对正常细胞的增殖有促进或抑制作用,因此miRNA表达异常可能诱发癌症等各种疾病。利用细胞凋亡实验研究某些miRNA对正常细胞和癌细胞增殖的影响,可能为一些疾病的诊断和治疗提供新的生物标志物。胰腺癌是一种恶性程度比较高的肿瘤,死亡率比较高而且早期临床表现不典型。近年来,胰腺癌生物标志物的研究受到了广泛的关注,其对胰腺癌早期诊断和治疗有着重要的作用。本课题第二部分实验通过生物图谱分析发现正常胰腺组织细胞中表达的hsa-miR491-5p （miR-491-5p）比胰腺癌细胞表达的高1200多倍,表明miR-491-5p在胰腺癌的发生过程中可能具有重要作用。本实验用不同剂量合成的miR-491-5p和构建的miR-491-5p的逆转录病毒载体pLNCX2-G491分别瞬时转染胰腺癌SW1990细胞,观察在niR-491-5p过表达情况下胰腺癌SW1990细胞的生长情况。具体实验如下：（1）用生物信息学软件预测出miR-491-5p在胰腺癌细胞中作用的靶基因,并用Western blotting、RT-PCR、qRT-PCR等实验证明预测靶基因的可靠性。（2）不同剂量化学合成的miR-491-5p和重组质粒pLNCX2-G491分别转染胰腺癌SW1990细胞后,用细胞流式实验和CCK-8实验分析过量表达的miR-491-5p对胰腺癌SW1990细胞增殖和凋亡的影响。（3）Western blotting实验找出miR-491-5p在胰腺癌细胞中发挥作用的信号通路。实验结果如下：（1）经生物信息学分析和Western blotting、qRT-PCR实验证明,Bcl-xL和TP53为miR-491-5p的靶基因。（2）在胰腺癌SW1990细胞中,过量表达的miR-491-5p可有效抑制靶基因Bcl-xL和TP53的mRNA和蛋白质的表达。（3）在胰腺癌SW1990细胞中,过量表达的miR-491-5p可抑制细胞增殖、促进细胞凋亡。（4）miR-491-5p激活胰腺癌SW1990细胞凋亡的信号通路为非依赖TP53的线粒体/细胞色素C介导的凋亡通路,且过量表达的miR-491-5p可抑制STAT3和PI-3K/Akt信号通路,但对Ras/MAPK信号通路没有影响因此,在胰腺癌SW1990细胞中过表达的miR-491-5p通过靶向作用于Bcl-xL和TP53基因而促进胰腺癌SW1990细胞凋亡。本课题的研究为胰腺癌早期诊断和治疗提供了潜在的生物标志物。