Acidithiobacillus ferrooxidans与Acidiphilium acidophilum共培养体系的协同作用及其生物浸出研究

论文摘要

化能自养微生物嗜酸氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillus ferrooxidans）与嗜酸异养菌Acidiphilium acidophilum之间在生物浸出及酸性矿坑水（AMD）之类极端酸性环境中存在的协同作用已引起广泛关注,但仍缺乏从生理和基因水平对其进行的全面而深入的研究。为深入了解此两种微生物之间的协同作用及其在生物浸出体系和AMD等极端酸性环境中的生态功能,并为AMD环境的修复提供一定参考,本文对这两种微生物组成的共培养进行了一系列的实验研究。本文研究内容主要包括：（1）评估RT-qPCR定量At. ferrooxidans和Aph. acidophilum细胞的相对数量的准确度；（2）用此两种微生物进行长期驯化形成共培养体系,然后对此两物种微生物群落的生长和生理活性进行检测；（3）从转录水平研究了At. ferrooxidans与碳代谢和铁代谢相关基因在不同培养体系中的表达差异；（4）检验此共培养体系分别在Cd2+, Cu2+, Ni2+和Mg2+胁迫下的稳定性；（5）共培养体系受到葡萄糖抑制时的生长和生理活性；（6）将此共培养体系应用于黄铁矿和低品位黄铜矿的生物浸出实验。上述研究所得结果如下：（1）利用RT-qPCR定量At. ferrooxidans以及Aph. acidophilum这两种微生物的相对数量时,用于DNA提取的培养物中微生物细胞总量应在6.52×109cells至2.61×1010cells之间,能得到准确的定量结果,并且在两种微生物混合的条件下其各自的特异性引物能确保实验结果互不产生干扰；（2）成功的构建由At. ferrooxidans和Aph. acidophilum这两种微生物组成的共培养物,并基于其RT-qPCR定量的生长动态变化可知,共培养体系的At. ferrooxidans能更快的进入对数生长期并且对数生长期延长2天以上,数量较其在纯培养中高出5倍以上。（3）亚铁氧化及其与铁代谢相关的基因表达研究结果表明,共培养中的At. ferrooxidans对能源的获取能力明显高于其纯培养。另外,对At. ferrooxidans中与CO2固定相关基因表达的结果分析说明编码RuBisCO的第二套结构基因cbbLS-2和正向调控基因cbbR在共培养体系中的表达均上调。（4）在Cd2+, Cu2+, Ni2+和Mg2+这4种金属离子分别存在的条件下异养菌Aph. acidophilum均能促进At. ferrooxidans对亚铁的氧化,提高其对能源利用的效率。共培养体系中的异养菌Aph. acidophilum使At.ferrooxidans对Cu2+的最大耐受浓度（MTC）由2.0g/L提高到5.0g/L而且共培养在5.0g/L Cu2+条件下的细胞数量与2.0g/L Cu2+条件下生长的At. ferrooxidans纯培养相似。另外,共培养中的At. ferrooxidans对Mg2+的MTC也由12.0g/L提高到17.0g/L。（5）无论是否加入葡萄糖,共培养对Fe2+氧化的效率均较At.ferrooxidans纯培养高。当葡萄糖浓度为5g/L时,At. ferrooxidans纯培养失去对Fe2+的氧化能力,而共培养仍能在100h内将所有的Fe2+氧化完,且加入葡萄糖越多的培养体系氧化终点的pH值也越高。在不加入葡萄糖的条件下At. ferrooxidans与Aph. acidophilum数量比在100：1的数量级,表明以这两种菌为代表的自养菌和异养菌在自然条件下生物量的比例。无论纯培养还是共培养的At. ferrooxidans数量均随葡萄糖浓度的提高而减少,且延滞期则变长；而异养生长的Aph. acidophilum则相反。（6）生物浸出实验中嗜酸异养菌Aph. acidophilum促进了At. ferrooxidans对黄铁矿样品的浸出,浸出率较其纯培养提高了22.7%；但在含铁量较低的低品位黄铜矿浸出体系中共培养和At. ferrooxidans纯培养的浸出率均低于33%。在加入2.0g/L Fe2+的低品位黄铜矿浸出体系中,共培养和At. ferrooxidans纯培养的浸出率均得到提高,分别达到52.22%和41.27%。综合上述所有结果表明,经长期驯化成功构建了由At. ferrooxidans和Aph. acidophilum组成的共培养体系,且利用RT-qPCR能准确定量此共培养中两种微生物的相对数量变化。异养菌Aph. acidophilum能与At. ferrooxidans一起在共培养中进行异养生长并对At. ferrooxidans的生长有促进作用；At. ferrooxidans通过上调表达与亚铁氧化相关的基因和第二套cbbLS结构基因来提高对亚铁的氧化和CO2的固定。由于Aph. acidophilum能促进At. ferrooxidans对亚铁的氧化,并能缓解或消除葡萄糖对At. ferrooxidans的抑制,所以不能以加入类似于葡萄糖的有机物作为AMD环境生物修复的手段,且适合进行Fe2+氧化的At. ferrooxidans与Aph. acidophilum的数量比例范围应在100：1的数量级。Aph. acidophilum与At. ferrooxidans共培养在一定的环境胁迫下仍能保持其稳定性并完成各自的生态功能,并且嗜酸异养菌Aph. acidophilum适合在含铁量较高的浸出体系中与铁氧化细菌共同作用来提高生物浸出的效率。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 1 文献综述
• 1.1 微生物冶金的重要意义
• 1.2 微生物冶金的历史和研究现状
• 1.2.1 微生物冶金的历史
• 1.2.2 硫化矿物的生物浸出
• 1.2.3 生物浸出体系中的微生物多样性
• 1.2.4 多种微生物混合浸出的研究情况
• 1.3 At.ferrooxidans（嗜酸氧化亚铁硫杆菌）
• 1.3.1 At.ferrooxidans的分类学研究
• 1.3.2 At.ferrooxidans的亚铁氧化
• 1.3.3 At.ferrooxidans的碳同化
• 1.4 Aph.acidophilum（氧化硫嗜酸菌）
• 1.5 At.ferrooxidans与Aph.acidophilum混合浸矿研究
• 1.6 RT-qPCR技术及其在微生物学中的应用研究
• 1.6.1 RT-qPCR原理
• 1.6.2 荧光扩增曲线
• 1.6.3 荧光阈值和Ct值
• 1.6.4 实时荧光定量PCR技术的定量方法
• 1.6.5 RT-qPCR的影响因素及其优化
• 1.6.6 RT-qPCR在微生物中的应用
• 1.7 本论文的研究目的和意义
• 2 RT-qPCR定量的可靠性评估及应用
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 微生物的培养
• 2.2.2 DNA提取
• 2.2.3 RT-qPCR引物及其特异性检测
• 2.2.4 Real-time qPCR
• 2.2.5 培养物用量评估
• 2.2.6 RT-qPCR定量效果检验
• 2.3 结果
• 2.3.1 DNA提取效果
• 2.3.2 RT-qPCR引物特异性
• 2.3.3 DNA提取所需培养物的用量
• 2.3.4 RT-qPCR定量效果
• 2.4 讨论
• 2.4.1 DNA提取时所需的总细胞数量范围
• 2.4.2 线性拟合图系统误差产生的原因
• 2.5 本章小结
• 3 共培养体系的构建及其生长动态变化规律研究
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 共培养体系的构建及验证
• 3.2.2 亚铁氧化及pH值的测定
• 3.2.3 微生物相对数量变化检测
• 3.3 结果
• 3.3.1 共培养的驯化
• 3.3.2 共培养体系的验证
• 3.3.3 At.ferrooxidans纯培养及共培养的生长动态变化
• 2+氧化及pH值比较'>3.3.4 At.ferrooxidans纯培养和共培养对Fe²⁺氧化及pH值比较
• 3.4 讨论
• 3.4.1 构建共培养体系时物种的选择
• 3.4.2 构建共培养体系时培养基的选择
• 3.4.3 共培养体系中两种微生物的生长状态
• 3.5 本章小结
• 2+氧化和CO₂固定基因表达差异'>4 纯培养与共培养Fe²⁺氧化和CO₂固定基因表达差异
• 4.1 实验材料
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 微生物的培养和细胞收集
• 4.2.2 RNA提取、纯化及反转录成cDNA
• 4.2.3 RT-qPCR及其特异性引物
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 RT-qPCR引物的特异性
• 2+氧化相关基因表达差异'>4.3.2 纯培养与共培养Fe²⁺氧化相关基因表达差异
• 2固定相关基因的表达差异'>4.3.3 纯培养与共培养CO₂固定相关基因的表达差异
• 4.4 讨论
• 4.4.1 共培养对能源的高效利用
• 4.4.2 共培养对碳源的循环利用
• 4.4.3 共培养的铁代谢与碳代谢
• 4.5 本章小结
• 5 葡萄糖对At.ferrooxidans纯培养及共培养的影响
• 5.1 实验材料
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 微生物的培养
• 2+氧化及pH值的测定'>5.2.2 Fe²⁺氧化及pH值的测定
• 5.2.3 微生物相对数量变化检测
• 5.2.4 RNA提取、纯化及反转录成cDNA
• 5.2.5 RT-qPCR
• 5.3 实验结果
• 5.3.1 葡萄糖对纯培养及共培养生理活性的影响
• 5.3.2 葡萄糖对两种微生物生长量的影响
• 5.3.3 葡萄糖对亚铁氧化相关基因表达的影响
• 5.4 讨论
• 5.4.1 共培养的协同作用与其对葡萄糖的耐受
• 5.4.2 葡萄糖对At.ferrooxidans的抑制与生物修复
• 5.5 本章小结
• 6 纯培养与共培养对四种金属离子抗性差异及生物浸出
• 6.1 实验材料
• 6.1.1 菌株
• 6.1.2 实验矿样
• 6.2 实验方法
• 6.2.1 微生物培养及检测
• 2+氧化及pH值的测定'>6.2.2 Fe²⁺氧化及pH值的测定
• 6.2.3 金属抗性实验
• 6.2.4 微生物浸出实验
• 6.3 结果
• 6.3.1 纯培养与共培养对四种金属离子的抗性
• 6.3.2 黄铁矿浸出实验
• 6.3.3 低品位黄铜矿浸出实验
• 6.4 讨论
• 6.4.1 生物浸出体系中嗜酸菌的金属离子抗性
• 6.4.2 含铁量对浸出效率的影响
• 6.4.3 黄铁矿生物浸出的过程
• 6.5 本章小结
• 7 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间主要研究成果