利用大肠杆菌优选密码子高效表达Aβ42肽的研究

论文摘要

阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease, AD）是一种多发生在老年人群中以进行性认知障碍和记忆力损害为主的中枢神经系统退行性疾病,以痴呆为主要表现,其典型的病理特征是老年斑（senile plaques, SP）和神经纤维缠结（neurofibrillary tangles,NFT）及神经元原发变性、坏死。目前,一种极易形成淀粉样纤维的多肽Aβ被普遍认为是AD的主要病原蛋白。这种20世纪80年代以来从细胞分子生物学水平研究得出的“β淀粉样蛋白（Aβ）学说”对于该病的研究起到重要进展,一般β淀粉样蛋白（Aβ）在脑组织中的沉积可能是阿尔茨海默病发生、发展的中心环节。由于Aβ的体外神经细胞毒性实验以及研究其与相关信号传导蛋白之间相互作用的实验都需要获得大量重组蛋白,尤其是可溶的分泌型重组蛋白,而目前Aβ42的多肽通常是利用化学合成的方法合成,该方法不仅费时而且需要精密的仪器,而且费用十分昂贵,因此寻找经济快捷的Aβ42肽的表达方法则具有重要意义。本研究采用大肠杆菌优选密码子,通过基因工程手段,用pET28a载体和E.coli BL21菌株表达不加标签的Aβ42肽,构建了具有T7表达系统的重组质粒pET28-Aβ42a、并实现了Aβ42肽在BL21菌株的细胞内大量表达,根据Aβ42肽的自身特性,例如分子量为4.5 kDa,PI 5.6等分子量小,等电点低,尤其是Aβ42肽在溶液中极易聚集等特点,分别利用包涵体变性和复性及离子交换梯度溶出等方法尝试纯化Aβ42肽,对包涵体的提取、溶解、和多种复性方法进行了并行比较及深入研究。通过在培养基溶液中添加不同种类的盐离子,尝试达到Aβ42肽的最大表达量以及最高可溶性表达。实验结果表明,在0.75mmol/L IPTG诱导,37℃条件下培养3hAβ42可达最高表达量,而加入乙酸钠可以有效促进Aβ42肽的表达,随着乙酸钠浓度的升高表达量也有逐步升高的趋势,无论是上清和沉淀中表达量均增加。说明乙酸钠能够促进Aβ42肽的表达,同时本研究也初步测试了不同的培养基溶液pH值对于Aβ42肽的表达量的影响,结果表明不同的pH值条件下Aβ42肽表达量也有一定程度的变化,从而为下一步选择最适培养条件提供实验依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 0.1 阿尔茨海默病的研究进展及致病危害
• 0.2 阿尔茨海默病的致病机理及致病蛋白 Aβ的研究现状
• 0.3 与阿尔茨海默病相关的基因概述
• 0.4 大肠杆菌表达系统
• 0.5 表达 Aβ42 肽的目的与意义
• 第1章 质粒载体构建及克隆菌株的筛选和表达
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 主要试剂工具酶和试剂盒
• 1.1.3 主要仪器
• 1.1.4 培养基的配制
• 1.1.5 分子生物学以及生物化学实验的操作
• 1.2 实验结果
• 1.2.1 基因合成
• 1.2.2 基因操作及诱导表达
• 1.3 本章小结
• 第2章 Aβ42 肽的大量表达及纯化
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 主要药品、工具酶和试剂盒
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 实验试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 使用 IPTG 诱导蛋白表达
• 2.2.2 包涵体分离
• 2.2.3 对破壁后的样品的上清和沉淀分别进行纯化
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 IPTG 浓度
• 2.3.2 诱导时间
• 2.3.3 诱导温度
• 2.3.4 超声破壁
• 2.3.5 对超声破碎后样品进行 tricine-SDS-PAGE 电泳
• 2.4 本章小结
• 第3章 加入不同的盐对于提高大肠杆菌中 Aβ42 肽的表达 量以及促进其可溶性表达的影响
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 主要试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 不同盐溶液对大肠杆菌表达 Aβ42 的影响
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 加入 IPTG 诱导同时加入不同的盐诱导 Aβ42 表达影响
• 3.3.2 在加入IPTG 诱导同时加入不同的有机盐溶液诱导Aβ42 肽表达
• 3.3.3 不同乙酸钠盐浓度对IPTG 诱导大肠杆菌表达的影响
• 3.3.4 加入乙酸钠诱导前后菌液pH 值的变化
• 3.3.5 pH 对大肠杆菌表达Aβ42 肽的影响
• 3.4 本章小结
• 结论与展望
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文及参加科研情况