论文题目: 以P185～（erbB-2）蛋白为靶标的单链抗体的筛选
论文类型: 硕士论文
论文专业: 生化药学
作者: 刘阳
导师: 黄俞炜源
关键词: 单链抗体,大肠杆菌,噬菌体抗体库
文献来源: 沈阳药科大学
发表年度: 2005
论文摘要: erbB-2，又称HER2／neu，是酪氨酸激酶癌基因家族中的一员，编码跨膜受体样的磷酸化糖蛋白(185kD，简称P185erbB2)。约25％的乳腺癌、卵巢癌等恶性肿瘤中出现erbB-2基因的突变或过度表达。为了能够得到针对P185erbB2蛋白的单链抗体，本课题进行了以下实验研究： 首先，运用生物信息学分析手段和检索已报导的研究成果，认定P185erbB-2蛋白胞外近膜区部分是一个抗肿瘤治疗靶点，故确定该段基因作为要表达的目的抗原。从乳腺癌细胞系sk-br-3中抽提出总RNA，扩增出其胞外近膜区部分aa 505-625基因，构建原核表达载体，并实现该基因在大肠杆菌中的高效表达，表达量占菌体胞内可溶性蛋白总量的30％。通过金属螯合层析，回收到电泳纯级别的目的蛋白。 其次，使用该抗原以固相法对大容量噬菌体抗体库进行3轮筛选，借助ELISA法鉴定出多株阳性克隆，并在蛋白质水平上鉴定其特异性，并比较其相对亲和力。 最后，将2株较有价值的重组子的单链抗体部分克隆到带e-tag标签蛋白的原核表达载体pTIG-e中，为下一步在细胞水平和组织水平上鉴定其亲和力和特异性研究奠定了基础。
论文目录:
中文摘要
ABSTRACT
英文缩略语表
第1章 引言
1.1 erbB-2基因及P185蛋白
1.2 基因工程抗体和抗体库技术的研究进展
1.3 P185~(erbB2)蛋白为靶标的治疗性抗体的研究进展
第2章 P185~(erbB-2)蛋白胞外区基因的克隆及其在大肠杆菌中的可溶性表达
2.1 材料
2.1.1 菌株和质粒
2.1.2 寡核苷酸引物
2.1.3 主要工具酶及试剂盒
2.1.4 主要生化试剂
2.1.5 主要试剂的配制
2.1.6 主要仪器设备
2.1.7 计算机软件包
2.2 方法
2.2.1 细胞培养
2.2.2 细胞总RNA的提取
2.2.3 RT-PCR扩增cDNA第一条链
2.2.4 PCR扩增目的DNA片段
2.2.5 DNA片段的回收
2.2.6 DNA的定量
2.2.7 限制性内切酶消化DNA分子
2.2.8 DNA片段的连接
2.2.9 转化
2.2.10 SDS—PAGE
2.2.11 目的蛋白的诱导表达
2.2.12 透析袋的处理
2.2.13 带His-tag目的蛋白的纯化
2.2.14 Western blot检测
2.2.15 目的蛋白的浓度测定
2.3 结果
2.3.1 G3N1基因与ERB基因的分离
2.3.2 G3N1、ERB基因的分离及重组表达载体的构建
2.3.2.1 重组载体pET-GN的构建
2.3.2.2 重组载体pET-GE的构建
2.3.3 GERB蛋白的可溶性表达与western blot分析
2.3.4 GERB蛋白的纯化及定量
2.4 讨论
2.4.1 表达区域的选择
2.4.2 影响外源蛋白表达的因素
2.4.3 外源蛋白表达的检测
第3章 应用噬菌体展示技术筛选抗P185~(erbB-2)的单链抗体
3.1 材料
3.1.1 菌种与质粒
3.1.2 抗体库
3.1.3 主要试剂
3.1.4 主要设备及耗材
3.1.5 寡核苷酸引物
3.2 方法
3.2.1 辅助噬菌体的制备
3.2.2 重组噬菌体人ScFv抗体库的扩增
3.2.3 噬菌体抗体库和辅助噬菌体滴度的测定
3.2.4 单链噬菌体抗体库的富集筛选
3.2.5 噬菌体结合子的鉴定
3.2.6 阳性噬菌体结合子ScFv基因的克隆与序列分析
3.2.7 ScFv克隆入含E-tag的表达载体
3.3 结果
3.3.1 单链噬菌体抗体库的富集筛选
3.3.2 噬菌体结合子的鉴定
3.3.3 测序结果
3.3.4 ScFv克隆入含E-tag的表达载体
3.4 讨论
3.4.1 单链抗体的特性
3.4.2 噬菌体抗体库技术
3.4.3 噬菌体抗体库的筛选
3.4.4 抗P185~(erbB-2)蛋白的筛选
第4章 结论
参考文献
作者研究生期间发表的论文
致谢
发布时间: 2006-11-27
参考文献
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