论文摘要
第一部分混旋聚乳酸/纳米羟基磷灰石组织相容性研究坚强内固定已经广泛应用于颅颌面部骨折、正颌外科以及各种原因导致的骨缺损移植病例。随着钛板的应用,金属内固定系统的组织相容性得到了很大改善。然而金属内固定系统存在诸多缺陷,诸如：金属材料的机械性能与骨相差较大,导致应力分布不均；存在应力遮挡效应,妨碍初期骨痂的迅速形成；在儿童患者,由于妨碍颅面骨的发育,需二次手术等。因此,可吸收板以及相关材料的研究已广泛展开,并通过局部使用生长因子、改善局部微环境来提高实验或临床效果。目前,可吸收板已经广泛应用于颅颌面部骨折和骨切开手术,但一些病例出现了感染、异物反应、错合和错位骨连接等并发症,这与可吸收板的生物相容性、降解速度、降解过程中力学强度的变化以及可吸收板及其降解产物对周围环境的影响有关。混混旋聚乳酸是一种优良的医用高分子材料,具有无毒性、可生物降解性和易于加工等优点,已经广泛应用于组织工程、药物载体、骨内固定等领域。尽管混旋聚乳酸在体内可以完全降解,但它是一种非结晶态材料,由于分子量小,其机械强度低,降解速度过快,往往只用于松质骨固定。在混旋聚乳酸材料中加入一定量的生物陶瓷后,能够增加其机械强度,减缓降解速度,其生物力学性能适宜于制作用于骨折内固定的可吸收板。羟基磷灰石（hydroxyapatite, Ha）具有良好的生物活性和骨传导活性,广泛的应用于骨缺损的修复重建。然而,由于HAP的力学性能较差、脆性大、对负荷承载性差,在体内不能被吸收,从而限制了它的临床应用。PDLLA/nano-Ha板是在PDLLA基质中加入一定比例的nano-Ha,能够增强可吸收板的机械强度,减缓降解速度,促进骨愈合。然而在一些长期研究中,可吸收材料的最终降解产物会引起宿主的免疫反应,发生炎性变化,甚至化脓。我们期望通过对该材料与成骨细胞的共培养来研究其对成骨细胞生长、繁殖的影响,探讨该材料是否存在细胞毒性作用。用于体外研究的成骨细胞已成系列,包括原代分离培养的成骨细胞及克隆传代的成骨样细胞株。原代培养获取成骨细胞的方法有组织块法、酶消化法、骨膜组织块法、骨髓组织块法以及薄层骨片经EDTA处理并经胶原酶消化,但所得到细胞的纯度不一。两种酶混合多次消化、反复贴壁等方法能够获得纯度较高的细胞。胎鼠颅骨细胞是骨形成细胞,属成骨前体细胞,对骨组织的生长、发育、骨代谢平衡、骨量维持和损伤修复起关键作用,将其与PDLLA/nano-Ha共培养,可以观察PDLLA/nano-Ha对这种成骨前体细胞粘附及增殖的影响。通过观察细胞周期的变化来了解PDLLA/nano-Ha对成骨细胞增殖的影响可以分析PDLLA/nano-Ha的组织相容性。另外,成骨细胞形态的变化直接影响细胞的功能。因此,混旋聚乳酸（PDLLA）是一种具有良好生物相容性和生物降解性的聚合物,但亲水性较差,降解中间产物乳酸偏酸性可能会抑制成骨细胞生长,还有因降解速度较快导致机械强度保持时间不够等缺点。PDLLA/nano-Ha板复合材料中的nano-Ha可能改善其性能,使其在体内不影响骨愈合或对骨愈合具有一定程度的积极作用。对PDLLA/nano-Ha影响成骨细胞基因调控过程的研究将有助于了解PDLLA/nano-Ha促成骨的机制,并将为研究骨缺损病变的修复过程和影响因素及加速骨重塑的方法等提供大量的信息。骨核心结合因子α1（Cbfα1）是成骨细胞分化和骨发育的控制基因,对牙骨质及牙槽骨的发育同样有重要作用。成骨细胞内碱性磷酸酶（ALP）的mRNA转录在其增殖早期就已经出现,在增殖后期,其ALP活性可增加2-3倍,然而mRNA的转录水平则仍可维持较低水平。骨钙素（BGP）的mRNA表达在矿化期开始,并逐渐达到高峰。Ⅰ型胶原蛋白（Col-Ⅰ）和ALP等的表达不仪代表了成骨细胞的不同分化阶段,而目.它们往往对成骨细胞的表型发育起着一定的诱导作用。钙、磷是体内必需的矿物元素,也是体内最多的矿物元素,是构成骨骼的主要成分。本部分研究旨在通过检测混旋聚乳酸／纳米羟基磷灰石板对胎鼠颅骨成骨细胞及细胞增殖的影响、成骨细胞内Cbfα1、ALP、Col-I和BGP的mRNA的表达以及培养环境中钙、磷成分的变化,探讨PDLLA/HAP的生物相容性、影响成骨细胞基因的调控机制及其对培养环境的作用,以期为PDLLA/nano-Ha板的实验研究和临床应用提供理论依据。实验一胎鼠成骨细胞原代培养方法的建立及鉴定本实验的目的为采用两种酶混合多次消化、反复贴壁等方法,以获得孕21天胎鼠颅骨中的大量纯度较高的成骨细胞,为骨代谢的研究奠定基础Ⅱ。材料与方法分离21天孕龄的SD大鼠胎鼠颅骨,剪碎,用Ⅱ型胶原酶（2mg/ml）及胰酶（0.25%）的混合液消化,将后三次所得悬浮液混合后离心,收集细胞,重悬后接种于培养瓶内。采用“反复贴壁法”再次纯化成骨细胞。待培养瓶的成骨细胞长满90%后,加入适量的0.25%的胰蛋白酶再次消化并传代。用倒置显微镜观察原代培养的细胞形态,并进行摄片。采用RT-PCR技术检测及矿化结节染色鉴定成骨细胞。RT-PCR取第2代胎鼠颅骨成骨细胞,设计引物,每个样本设3个重复。矿化结节染色法为取第2代胎鼠颅骨成骨细胞接种于6孔板内,用骨诱导培养基继续培养,7天后进行改良Von Kossa染色。结果原代胎鼠颅骨细胞光镜下表现为细胞体积较大,呈鳞片状,胞浆丰富,多伪足。RT-PCR结果骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白、内参β-actin基因的扩增曲线平滑,均有明显的指数扩增期,扩增效率良好。钙化结节染色培养板底长出肉眼可见的结节样结构,见大量黑色结节状物形成。结论两种酶混合多次消化与差速贴壁纯化法,使分离的成骨细胞具有数量大、纯度高、生长旺盛和成活率高等优点。实验二PDLLA/nano-Ha对胎鼠颅骨细胞形态及细胞增殖的影响本实验主要通过扫描电镜、细胞周期的变化、细胞增殖的检测等方法观察成骨细胞在体外与PDLLA/nano-Ha共培养时其在该材料上形态特征的变化,探讨材料对成骨细胞形态特征和增殖活性的影响。材料与方法将PDLLA/nano-Ha的材料块制成底面长宽为10mmm*7mm,高3mm的块状,共33块,环氧乙烷消毒备用。PDLLA/nano-Ha为实验组,聚氯乙烯为对照组。本研究在更换条件培养液前均用不完全的培养液培养24h,使细胞同处在GO期。本实验结果均由第四代成骨细胞所得。用完全培养液浸透实验材料24h,接种第四代胎鼠颅骨细胞到各组材料中培养。在培养的第1d,4d,7d取出材料,固定,乙醇脱水,无水乙醇脱水冷冻干燥、喷金,扫描电镜下观察。成骨细胞增殖的检测采用cck-8法。将第四代胎鼠颅骨细胞等量接种到各组材料表面,不加材料、细胞及培养液为空白对照。分别在培养第4、7、14、21d结束前4h加入cck-8试剂,孵育,将悬液转移至96孔板内,在酶标仪上读取450nm波长下的OD值。成骨细胞细胞周期的检测为接种第四代胎鼠颅骨细胞至装有材料块（设置阴性对照和空白对照）的12孔板中,培养4、7、14、21天,收集细胞,清洗,固定,离心,重悬,加入RNAse,30min；加入碘化丙啶（PI）,避光染色,流式细胞仪检测,根据软件分析每例标本的Gl期、S期和G2期细胞数,计算细胞各周期时相在细胞周期中所占百分比,进行细胞周期分析。以增殖指数（proliferation index,PI）表示各实验组对OB增殖的影响：PI=（S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）×100％。采用SPSS10.0软件的One WayANOVA进行统计分析。结果与PDLLA/nano-Ha组材料共培养1d,4d,7d后,扫描电镜观察结果表明细胞形态完整,表面粗糙,有丰富的针状突起,突起之间有连接,而且细胞开始重叠生长,随时间延长细胞的数量随之增多,细胞形态由突起于材料表面逐渐变为扁平,与材料紧密贴合。采用cck-8法检测与各实验材料共培养后细胞的增殖能力,发现各组细胞均随着培养时间的延长而增殖,在第4d进入对数生长期,细胞开始重叠生长,第14d达到峰值,后开始稍有减弱。与阴性对照组比较,PDLLA/nano-Ha组各时间点的吸光度值均较阴性对照组略低,没有显著差异（P>0.05）。流式细胞仪检测结果显示：4天时PDLLA/nano-Ha组能显著的诱导细胞停留在G2/M期（P≤0.05）,S期细胞明显少于阴性对照组（P≤0.05）；7天时PDLLA/nano-Ha组G2/M期的细胞稍少于对照组（P>0.05）,S期的细胞百分比显著少于对照组（P≤0.05）,滞留在G0/G1期的细胞则稍多于对照组（P>0.05）,但较4天时S期的细胞明显增多（P≤0.05）;14天时S期细胞明显多于对照组（P≤0.05）,但G2/M期显著少于对照组（P≤0.05）,G0/G1期与对照组差异不明显（P>0.05）：21天时PDLLA/nano-Ha组S期细胞显著少与对照组（P≤0.05）,滞留在GO/G1期的细胞较对照组稍高（P>0.05）,但明显比PDLLA/nano-Ha组4天,7天,14天时增多（P≤0.05）,G2/M期的细胞百分比较对照组略低,但明显比PDLLA/nano-Ha组4天,7天,14天时降低（P≤0.05）。增殖指数PI值,PDLLA/nano-Ha组在4,7,14,21天时均略低于对照组（P>0.05）,在4天,7天时逐渐升高,在14天时开始降低。结论在与PDLLA/nano-Ha共培养时,成骨细胞可以在PDLLA/nano-Ha材料表面很好的粘附和增殖,PDLLA/nano-Ha对成骨细胞形态和增殖的影响很小。PDLLA/nano-Ha对成骨细胞还有一定促成骨细胞分化的潜力。实验三PDLLA/nano-Ha对成骨细胞标志性蛋白mRNA表达及细胞培养环境的影响本实验通过细胞与PDLLA/nano-Ha共培养,研究其对成骨细胞内Cbf α1、 ALP、Col-I和BGP的mRNA表达影响,探讨PDLLA/nano-Ha影响成骨细胞基因可能存在的调控机制;并根据培养环境中钙、磷浓度的变化,分析其对培养环境的影响,以期为PDLLA/nano-Ha板的实验研究和临床应用提供理论依据。材料与方法将PDLLA/nano-Ha制备成一定大小消毒备用。接种第四代胎鼠颅骨细胞到各组材料中,培养,隔日换液。分别在换液后第4、7、14、21天收样。提取总RNA-70℃保存备用。根据GenBank中鼠β-actin mRNA、ALP mRNA、 Col-I mRNA、Cbfal mRNA和BGP mRNA全序列,应用Clone Manager设计引物,每个样本设3个重复。Ca、P含量检测采用收集第2,4,6,8,10,12,14,16,18,20天的培养液各10ml,参照周国君的方法于原子吸收分光光度仪测Ca、P吸光度值,绘制工作曲线,计算Ca、P离子浓度。采用SPSS10.0软件的One Way ANOVA进行统计分析。结果两组Cbf α1mRNA从第4天开始表达,随着细胞的增殖而增加。在第4、7、14、21天时,PDLLA/nano-Ha组成骨细胞Cbf α1mRNA的表达水平明显高于对照组,两者有显著差异。两组Col-I mRNA从增殖初期开始表达后,表达水平在第7天后明显提高,而且随着培养时间延长而增加。在第7、14、21天时,PDLLA/nano-Ha组成骨细胞Col-I mRNA的表达水平明显高于对照组,两者有显著差异（P<0.01）。随着细胞的增殖,成骨细胞内ALP mRNA的表达水平先增高后降低,在第7天时达到最高。在第4,7,14天时,PDLLA/nano-Ha组成骨细胞ALP mRNA的表达水平明显高于对照组,两者有显著差异（P<0.01）。随着细胞进入矿化期,两组成骨细胞ALP mRNA表达均减少。BGP mRNA从第4天开始表达,在14天时达到峰值。在第4、7、14、21天时,PDLLA/nano-Ha组成骨细胞Cbf α1mRNA的表达水平明显高于对照组,两者有显著差异（P<0.01）。培养环境中Ca含量检测显示除第16天、第18天外,PDLLA/nano-Ha组培养液中Ca离子含量高于对照组,差异明显（P<0.05）;在第14天后突然降低,PDLLA/nano-Ha组下降幅度明显高于对照组（P<0.05）。磷酸盐含量测定结果显示在第6天,第8天,10天,12天,14天,16天时PDLLA/nano-Ha组培养液中磷酸盐含量低于对照组,第16天时差异最明显（P<0.05）, PDLLA/nano-Ha组下降幅度略高于对照组（P>0.05）,第4天时缓缓升高,14天时再次大幅降低,在第16天时最低,PDLLA/nano-Ha组下降幅度明显高于对照组（P<0.05）,18天后两组磷酸盐含量均缓缓上升。结论成骨细胞与PDLLA/nano-Ha复合材料共培养后,在细胞增殖后期,均能促进Cbfα1、ALP、Col-I和BGP的mRNA表达;在基质成熟与矿化期抑制ALP的mRNA表达,在矿化期减少BGP的mRNA表达,但Cbfα1、Col-I的mRNA表达被不断加强,表明在增殖后期与分化早期PDLLA/nano-Ha能不断促进成骨细胞分化,而在分化晚期（矿化期）却降低了细胞分化的速度。同时PDLLA/nano-Ha还通过改变培养液钙磷浓度促进成骨细胞分泌的体外基质矿化。第二部分PDLLA/nano-Ha可吸收板固定兔下颌骨骨折的实验研究本部分在第一部分的基础上,通过研究PDLLA/nano-Ha可吸收板固定下颌骨骨折的愈合过程,探讨该可吸收板在颌骨骨折的可行性,并通过局部使用富含血小板血浆（Platelet-rich Plasma, PRP）,以促进骨折愈合进程,减少并发症的发生材料和方法将混旋聚乳酸/纳米羟基磷灰石可吸收板性能同第一部分,制成定大小消毒备用。选取成年雄性、体重2.5-3.0kg新西兰兔32只为实验动物。制备PRP。将32只新西兰兔随机分为2周、4周、8周和12周4个时间段,每个时间段8只。每时间段随机分为两组,每组四只,分别为PDLLA/nano-Ha可吸收板组和PDLLA/nano-Ha可吸收板+PRP组。分别于两侧下颌骨造成实验性骨折,用PDLLA/nano-Ha可吸收板固定,一侧加PRP,另一侧不加。进行大体观察、X线检查,HE染色和透射电镜观察以及免疫组织化学检查。大体观察：观察实验动物术后全身一般情况,注意骨折局部伤口情况,是否有红肿、溢脓、瘘道出现。骨折端有无移位及异常活动。X线检查：术后2、4、8、12周分批处死动物,取出下颌骨后在46Kv,100mA,0.04S,100cm的条件下进行X线摄片,观察骨折愈合情况。组织学检查：在连接骨痂部位取材两块,一块进行HE染色；另一块制成超薄切片,醋酸铀及枸橼酸铅双重染色,JM-1200透射电镜下观察。结果各组动物切口均Ⅰ期愈合,骨折无移位,咬合正常。标本大体观察显示2周时,PDLLA-nano/HA可吸收板组和PDLLA-nano/HA可吸收板+PRP组可吸收板表面均较粗糙,未见明显降解产物；骨断端可轻微活动,骨折线覆盖有致密组织,两组未见明显差别。4周时,PDLLA-nano/HA可吸收板组和骨折线仍可见,表面覆盖薄层骨痂。PDLLA-nano/HA可吸收板+PRP组骨折线较模糊,表面覆盖骨样组织,质地较硬。骨断端不活动。可吸收板表面均出现虫噬状吸收,少数板表面有少量乳白色降解产物。8周时,两组骨断端均为骨性连接,无活动。12周时,两组骨断端均为骨性连接,可吸收板有明显降解,但无碎裂。X线平片检查结果显示术后第2周,两侧骨折对位良好,无错位,骨折线清晰可见,骨皮质不连续,邻近骨小梁紊乱。术后第4周可吸收板侧骨折线稍模糊,骨髓腔内可见骨痂影像,邻近骨小粱仍然紊乱。术后第8周两组影像无明显区别,骨折线均模糊不清。术后第12周两组骨折线消失,骨小梁数量增多,骨小梁排列趋为整齐。光镜观察术后第2周,双侧骨折端有大量成纤维细胞和新生毛细血管,PDLLA-nano/HA可吸收板组骨折端附近可见少量成骨细胞和新生骨样组织。PDLLA-nano/HA可吸收板+PRP组可见较多的成骨细胞排列成排,附近有较多的新生骨样组织。术后第4周,PDLLA-nano/HA可吸收板组成骨细胞和成纤维细胞数目增多,新生骨样组织较第2周时增多,但骨折端仍有炎性细胞浸润,见图4-2; PDLLA-nano/HA可吸收板+PRP组骨折端成骨细胞和成纤维细胞丰富,炎性细胞减少,见图4-3；术后第8周,两组均可见新形成的骨小梁和软骨丰富,成骨细胞和破骨细胞多见。术后第12周,两组骨折区接近邻近正常骨组织结构,骨基质中骨细胞数目接近正常。骨小梁密集,排列与邻近骨组织中骨小梁相似。透射电镜观察显示骨折后第2周,PDLLA-nano/HA可吸收板+PRP组骨痂内可见到功能活跃的成骨细胞,细胞形态成长柱形,胞核卵圆或呈梭形,核仁明显,核周有异染色质聚集。胞浆内有丰富的粗面内质网和线粒体,高尔基器发达,见图4-4。PDLLA-nano/HA可吸收板组成骨细胞较扁平。术后第4和第8周,两组骨痂内成骨细胞数量均增多,功能极为活跃,有分裂增殖现象。骨痂内可见大量骨细胞,细胞形态长圆形或卵圆形,位于骨陷窝内,核周有异染色质聚集。结论PDLLA/nano-Ha可吸收板组织相容性好,降解速度适中,强度能够满足骨折固定的需要,使用PRP可能有助于骨创得早期愈合。