PS-TEPA、PS-g-PEG600树脂合成及其固载α-淀粉酶研究

论文摘要

本论文以聚苯乙烯树脂球为对象,通过氯乙酰化后,分别接枝四乙烯五胺或聚乙二醇链,合成两种新型树脂:PS-TEPA树脂、PS-g-PEG600树脂,用于α-淀粉酶的固定化。系统研究了树脂的接枝条件,固定化酶特性,采用荧光光谱分析方法考察了四乙烯五胺与α-淀粉酶、聚乙二醇600与α-淀粉酶相互作用。主要研究内容如下:1.单因素扫描实验表明:以二氯甲烷作分散剂,分散8 h,在合成温度为85℃,反应时间为12 h,投料比为32 g四乙烯五胺/g树脂条件下,从氯乙酰化聚苯乙烯树脂合成PS-TEPA型树脂的增重率和氮元素含量最大,分别为75%和8%;用1,4-二氧六环作分散剂,分散4 h,在合成温度为35℃,合成时间为6 h,投料比为2.875 g聚乙二醇钠/g树脂条件下,从氯乙酰化聚苯乙烯树脂合成PS-g-PEG600型树脂的增重率和氧元素含量最大,分别为37%和13%。2.固定化时间8 h,温度为30℃,pH值为8.0是PS-TEPA树脂对α-淀粉酶的最佳固载条件,酶活吸附率和蛋白吸附率最高可分别达到83%和72%;固定化时间10 h,温度为40℃,pH值为7.0是PS-g-PEG600树脂对α-淀粉酶的最佳固载条件,酶活吸附率和蛋白吸附率最高可分别达到60%和56%;在一定的浓度范围内,添加戊二醛对固定化酶的活性没有影响。3.固定化酶与自由酶的催化动力学性能研究结果表明:酶在固定化后的米氏常数Km值下降,对底物的亲和力上升;两种固定化酶的最大反应初速度vmax均比自由酶有所提高;酶在固定后的最适反应温度从40℃分别提高到50℃（PS-TEPA固定化酶）和60℃（PS-g-PEG600固定化酶）,最适pH值范围从pH 58变宽为pH 78（PS-TEPA固定化酶）和pH 710（PS-g-PEG600固定化酶）,增强了酶适应pH值波动的能力;固定化酶的抗洗脱和批式操作性能较好;酶的失活半衰期t1/2在固定化后显著延长,在70℃下,t1/2从1 h（自由酶）延长到4.5 h（PS-TEPA）和7.5 h（PS-g-PEG600）。4.应用荧光光谱、同步荧光光谱和紫外吸收光谱法分别研究了TEPA和PEG600与α-淀粉酶相互作用的机理。PEG600对α-淀粉酶有荧光敏化作用,斯卡查德（Scatchard）方程离解常数随温度的升高而增大;TEPA对α-淀粉酶有荧光淬灭作用,由Stern-Volmer方程和Lineweaver-Burk双倒数函数方程计算得到的淬灭类型为动、静态淬灭的结合,温度越高,静态淬灭越明显;TEPA与α-淀粉酶之间存在非辐射能量转移作用,平均结合位点数为1.31;同步荧光光谱证明添加PEG600会对酪氨酸残基的微环境产生很大的影响,添加TEPA只改变了色氨酸残基的微环境。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 酶固定化方法
• 1.1.1 吸附法
• 1.1.2 交联法
• 1.1.3 包埋法
• 1.1.4 共价结合法
• 1.1.5 热处理法
• 1.2 固定化酶载体的研究
• 1.2.1 载体的种类
• 1.2.2 有机聚合物载体
• 1.3 蛋白质的荧光光谱分析法
• 1.3.1 荧光光谱法简介
• 1.3.2 荧光淬灭法
• 1.3.3 荧光敏化
• 1.3.4 给受体之间的能量转移
• 1.3.5 结合过程中的热力学参数
• 1.3.6 同步荧光技术
• 1.3.7 荧光光谱的应用现状
• 1.4 α-淀粉酶固定化的研究进展
• 1.5 本论文研究的主要内容
• 1.5.1 有机聚合物作固定化载体的不足之处
• 1.5.2 研究内容
• 600树脂的合成'>第二章 PS-TEPA 和PS-G-PEG₆₀₀树脂的合成
• 2.1 实验材料及仪器
• 2.2 实验方法与步骤
• 2.2.1 聚苯乙烯树脂的预处理
• 2.2.2 氯乙酰化聚苯乙烯树脂的合成
• 2.2.3 树脂增重的计算
• 2.2.4 聚苯乙烯-四乙烯五胺树脂（PS-TEPA）的合成
• 600树脂(PS-g-PEG₆₀₀)的合成'>2.2.5 聚苯乙烯-g-聚乙二醇₆₀₀树脂(PS-g-PEG₆₀₀)的合成
• 2.2.6 元素分析
• 2.2.7 红外光谱分析
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 红外光谱图
• 2.3.2 PS-TEPA 树脂合成条件的选择
• 600 树脂合成条件的选择'>2.3.3 PS-g-PEG₆₀₀树脂合成条件的选择
• 2.4 小结
• 600树脂固载α-淀粉酶'>第三章 PS-TEPA 和PS-G-PEG₆₀₀树脂固载α-淀粉酶
• 3.1 实验材料及仪器
• 3.2 实验方法与步骤
• 3.2.1 α-淀粉酶酶活的测定
• 3.2.2 蛋白质含量的测定
• 3.2.3 α-淀粉酶的固定化
• 3.2.4 四乙烯五胺与聚乙二醇600 对α-淀粉酶活力的影响
• 3.2.5 戊二醛的影响
• 3.2.6 固定化酶与自由酶的酶促动力学
• 3.2.7 固定化酶的性能
• 3.2.8 固定化酶与自由酶的失活半衰期比较
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 吸附时间对酶固定化的影响
• 3.3.2 吸附温度对酶固定化的影响
• 3.3.3 吸附pH 值对酶固定化的影响
• 3.3.4 初始酶量对吸附的影响
• 3.3.5 四乙烯五胺与聚乙二醇600 对α-淀粉酶活力的影响
• 3.3.6 戊二醛交联对固定化的影响
• 3.3.7 固定化酶与自由酶的酶促动力学参数比较
• 3.3.8 固定化酶的性能初探
• 3.3.9 酶失活半衰期比较
• 3.4 小结
• 600、TEPA 与α-淀粉酶作用的荧光光谱分析'>第四章 PEG₆₀₀、TEPA 与α-淀粉酶作用的荧光光谱分析
• 4.1 实验材料及仪器
• 4.2 实验方法与步骤
• 4.2.1 缓冲溶液的配制
• 4.2.2 荧光光谱分析
• 4.2.3 荧光淬灭法
• 4.2.4 荧光敏化增强现象
• 4.2.5 给受体之间的能量转移
• 4.2.6 给受体之间的结合位点数
• 4.2.7 结合过程中的热力学参数
• 4.2.8 同步荧光技术
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 α-淀粉酶的激发波长的选择
• 4.3.2 不同pH 值下α-淀粉酶的荧光光谱
• 600 与α-淀粉酶作用的荧光光谱分析'>4.3.3 PEG₆₀₀与α-淀粉酶作用的荧光光谱分析
• 4.3.4 TEPA 与α-淀粉酶作用的荧光光谱分析
• 4.4 小结
• 第五章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文