MYB对杨梅果实花青素苷合成的调控及其机制

论文摘要

以‘荸荠’(Myrica rubra cv. Biqi)、‘东魁’(M. rubra cv. Dongkui)和‘水晶’(M.rubra cv. Shuijing)三种不同果实颜色的杨梅品种为试验材料,分析了花青素苷与果实色泽之间的关系,克隆得到花青素苷生物合成途径的结构基因和MYB转录因子,采用qPCR技术分析上述基因在不同品种杨梅果实、植株组织器官、果实发育阶段和果实套袋等处理中的表达模式,并开展了转录因子MYB与花青素苷生物合成途径相关编码基因的互作模式研究。通过烟草瞬时表达体系,验证了MYB转录因子的功能,明确了其对花青素苷生物合成途径相关基因的调控模式。主要结果如下：1、‘荸荠’杨梅果实中花青素苷总量最高,为85.40 mg/100g FW；‘东魁’杨梅果实中花青素苷总量为46.44 mg/100g FW；‘水晶’杨梅果实中检测不到花青素苷含量,三个品种对应的CIRG值分别为7.56、5.27和3.84。分析‘荸荠’杨梅不同组织器官中花青素苷含量,发现叶片中未检测到花青素苷,幼根和幼茎中含有少量的花青素苷,果实的花青素苷总量最高。‘东魁’和‘荸荠’杨梅64DAFB采收的果实中均未检测到花青素苷,随着果实的发育,CIRG值和花青素苷总量呈上升趋势。‘荸荠’杨梅套袋果实中的花青素苷总量仅为0.56 mg/100g FW,未套袋果实中花青素苷总量为108.99 mg/100g FW；未套袋果实CIRG值约为套袋果实的两倍。2、从成熟的‘荸荠’杨梅果实中克隆得到MrACT (227 bp)、MrCHS (440 bp)、MrCHI (301 bp)、MrF3H (436 bp)、2个DFRs (MrDFR1,221 bp; MrDFR2,221 bp)、MrANS (428 bp)、MrUFGT基因(647 bp)和2个R2R3 MYB基因(MrMYB1和MrMYB2)。从杨梅EST数据库中得到了MrF3’H基因(412 bp)和1个MrMYB3基因(514 bp)。MrCHS和MrF3H基因与其他物种中对应基因的序列同源性高达90%, MrDFR1基因与拟南芥中对应基因的同源性为83%,而MrUFGT基因与其他物种的对应基因的序列同源性介于51%和70%之间,其余基因与其他物种对应基因的序列同源性则介于68%和82%之间。3、采用RACE技术扩增非编码区序列,得到MrMYB1序列(966 bp)和MrMYB2序列(996 bp),其中MrMYBl为全长。MrMYB1和MrMYB2与拟南芥中R2R3 MYB基因家族成员的序列同源性较高,接近70%,而MrMYB3与拟南芥的MYB同源性仅为55%。MrMYB1和MrMYB2蛋白的序列同源性较高,均含有R2R3结构域。4. MrCHS和MrCHI在三个不同品种杨梅果实中表达相似,而其他基因在两个有色品种中的表达水平都高于‘水晶’杨梅,MrF3H、MrF3’H, MrDFR1和MrUFGT基因的转录水平与花青素苷含量呈正相关关系。在‘荸荠’杨梅的不同组织器官中,除MrCHI在幼根中表达水平最高之外,其余基因均在成熟果实中表达水平最高,其中MrUFGT基因仅在成熟果实中表达。在‘东魁’和‘荸荠’杨梅果实的不同生长发育阶段,除MrCHI和MrDFR2外,其他结构基因的表达水平和花青素苷总量成正比,且在‘荸荠’果实中的表达水平要高于‘东魁’果实。套袋处理明显抑制花青素苷生物合成途径中的结构基因表达。5、三个不同品种的杨梅果实中转录因子MrMYB1的表达水平与花青素苷总量呈正相关关系。转录因子MrMYB1只在成熟‘荸荠’果实中表达,而不在根茎叶中表达。‘东魁’和‘荸荠’杨梅的发育过程中,转录因子MrMYB1的表达逐渐增强,并在发育后期达到峰值。在套袋果实中转录因子MrMYB1的表达被显著抑制,表明光照可能通过影响MrMYB1表达进而影响果实花青素苷积累。6、烟草瞬时表达试验的结果表明,过量表达MrMYB1基因诱导烟草叶片中花青素苷积累。MrMYB1协同bHLH转录因子可激活AtDFR启动子,表明MrMYB1转录因子调控花青素苷生物合成途径中结构基因的表达,从而影响花青素苷合成。7、从‘水晶’、‘东魁’和‘荸荠’杨梅果实中分别克隆得到各自的MrMYBl全长序列。发现‘水晶’杨梅的MrMYB1(命名为MrMYB1d)在ATG起始密码子后第30位上缺失了一个胞嘧啶,导致移码突变,不能合成正常的MYB1蛋白；‘荸荠’杨梅仅含正常功能的MrMYB1基因,‘东魁’杨梅则同时含有MrMYB1和MrMYB1d基因。上述结果表明,MrMYB1调控杨梅花青素苷合成途径基因的协同表达。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• ABSTRACT
• 1 绪论
• 1.1 花青素与花青素苷
• 1.2 花青素苷与色泽
• 1.3 花青素苷的生物合成途径
• 1.3.1 查尔酮合成酶
• 1.3.2 查尔酮异构酶
• 1.3.3 黄烷酮3-羟化酶
• 1.3.4 类黄烷酮3'-羟化酶
• 1.3.5 二氢黄酮醇-4-还原酶
• 1.3.6 花青素苷合成酶
• 1.3.7 类黄酮3-O-葡糖苷转移酶
• 1.3.8 结构基因的协同作用
• 1.4 植物MYB基因与花青素苷的合成
• 1.4.1 植物MYB相关蛋白
• 1.4.2 R2R3 MYB基因家族与花青素苷的合成
• 1.4.3 MYB蛋白与其他蛋白协同调控花青素苷合成
• 1.5 花青素苷生物合成的影响因子和调控措施
• 1.5.1 影响花青素苷生物合成的因素
• 1.5.2 花青素苷生物合成的调控措施
• 1.6 杨梅与花青素苷
• 1.6.1 杨梅
• 1.6.2 杨梅果实颜色与花青素苷
• 1.6.3 杨梅花青素苷合成途径
• 1.7 研究内容与目标
• 2 与杨梅果实花青素苷相关的生理生化分析
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 色差测定和CIRG值计算
• 2.2.2 花青素苷总量测定
• 2.2.3 统计分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 不同处理样品的色差变化
• 2.3.2 不同处理样品的花青素苷总量差异
• 3 杨梅花青素苷生物合成途径结构基因和MYB转录因子的克隆
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 杨梅果实果肉组织总RNA的提取
• 3.1.2 cDNA合成
• 3.1.3 基因克隆和测序
• 3.1.4 利用RACE技术分离MYB全长序列
• 3.1.5 数据分析
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 杨梅花青素苷生物合成途径基因和actin基因的克隆
• 3.2.2 转录因子MrMYB的克隆
• 4 杨梅花青素苷生物合成途径结构基因的表达分析
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 总RNA提取及cDNA合成
• 4.1.3 实时定量PCR检测
• 4.1.4 数据处理
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 花青素苷合成途径基因在三个不同品种杨梅果实中的表达分析
• 4.2.2 花青素苷合成途径基因在‘荸荠’杨梅不同组织器官中的表达分析
• 4.2.3 花青素苷合成途径基因在两个品种杨梅果实不同发育阶段的表达分析
• 4.2.4 花青素苷合成途径基因在套袋和未套袋杨梅果实中的表达分析
• 5 转录因子MrMYB1的表达分析
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 试验材料
• 5.1.2 总RNA提取及cDNA合成
• 5.1.3 实时定量PCR检测
• 5.1.4 数据分析
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 转录因子MrMYB1在三个不同品种杨梅果实中的表达分析
• 5.2.2 转录因子MrMYB1在‘荸荠’杨梅不同组织器官中的表达分析
• 5.2.3 转录因子MrMYB1在两个品种杨梅果实不同发育阶段的表达分析
• 5.2.4 转录因子MrMYB1在套袋和未套袋杨梅果实中的表达分析
• 6 杨梅花青素苷合成途径中的转录因子MrMYB1的功能验证
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 试验材料
• 6.1.2 瞬时表达
• 6.1.3 数据分析
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 MrMYB1促进烟草叶片花青素苷积累并提高AtDFR启动子活性
• 7 三个杨梅品种中转录因子MrMYB1的序列差异
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 三个品种杨梅果实果肉组织总RNA的提取
• 7.1.2 cDNA合成
• 7.1.3 不同杨梅品种转录因子MrMYB1全长序列扩增
• 7.1.4 数据分析
• 7.2 结果与分析
• 7.2.1 三个不同品种杨梅的转录因子MrMYB1的全长序列分析
• 8 讨论
• 8.1 杨梅花青素苷生物合成途径的结构基因
• 8.2 杨梅R2R3 MYB基因的克隆及其对花青素苷合成的调控
• 8.3 MrMYB1功能验证及其与结构基因和bHLH的互作
• 8.4 MrMYB1序列突变对花青素苷积累的影响
• 9 小结与展望
• 9.1 小结
• 9.2 展望
• 参考文献
• 作者简历及在学期间所取得的科研成果