论文题目: 猪瘟病毒基因芯片诊断技术的研究及应用
论文类型: 博士论文
论文专业: 预防兽医学
作者: 杨林
导师: 赵德明
关键词: 猪瘟,序列分析,基因芯片,诊断方法
文献来源: 中国农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种猪病毒性传染病,猪瘟兔化弱毒疫苗有效地控制了猪瘟在我国的急性发生和大流行。但自上世纪80年代以来,我国开始出现了温和、非典型性猪瘟。究其原因,可能与CSFV出现了新的变异株等因素有关。尤其是亚临床感染猪,依靠常规诊断方法很难确诊并剔除此类病猪,给CSF的防制工作带来新的困难。因此,有必要建立一种新的迅速、准确诊断CSF的实验室诊断系统,为在我国彻底消灭CSF奠定基础。 基因芯片(Gene Chip)是生物技术与电子芯片融合的结晶,是由固定于固相载体(如硅片、玻璃、塑料等)表面的核苷酸阵列构成的一种新型微型器件。由于其快速、微量、准确的应用优点,正在成为新一代的自动化医学检验工具。通过设计针对基因的探针,与被检测基因的碱基序列互补匹配,可快速、准确地检测到基因,用于疫病的诊断。 本研究采用以基因测序为基础的系统进化树分析方法,对黑龙江省部分地区猪瘟病毒流行株进行分离鉴定和E2基因序列分析,并与传统的石门强毒和猪瘟兔化弱毒在抗原基因上存在的变异进行比较。研究结果表明:病料为CSFV感染,CSF流行毒株和疫苗株在核苷酸和氨基酸序列上存在一定的差异,E2基因部分序列接近Alfort,与Brescia同源性最低。该试验从核酸和蛋白质水平上研究了黑龙江省部分地区猪瘟病毒流行株与其它标准毒株之间的同源性及其变异情况,揭示了在该省猪瘟流行的本质,为实施科学有效的猪瘟防制措施提供依据。 本研究通过RT-PCR扩增CSAV相当保守的NS基因作靶DNA制作芯片,将被检样品在PCR过程中用Cy-5标记,得到DNA产物与芯片杂交,达到检测CSFV的目的,建立CSF基因芯片诊断方法;同时通过研究不同靶探针浓度对检测结果的影响,确立最佳反应条件靶探针浓度为1 μg/μl;分析芯片诊断技术的特异性和敏感性等技术指标:与RT-PCR方法和间接荧光抗体试验方法进行比较,并开展了初步应用。本研究建立的CSFV基因芯片诊断技术,可以成功地检测到CSFV保守区基因,荧光信号清晰,敏感性利特异性高,实际应用效果奸,是一种检出率高的诊断方法。 总之,本研究将基因芯片技术应用于动物疫病的诊断,成功建立了CSFV基因芯片诊断技术平台,解决了CSF诊断中的难题,具有重大的理论意义和应用价值。为今后利用基因芯片开展动物疫病诊断和研究提供理论依据,也为控制和消灭CSF奠定基础。但要实现基因芯片在动物疫病方面的广泛应用,还要做更深入的研究。
论文目录:
第一章 绪论
1.1 目的和意义
1.2 国内外研究现状
1.2.1 猪瘟病毒分子生物学研究概况
1.2.2 猪瘟实验室诊断技术的研究进展
1.2.3 基因芯片研究与应用概况
1.2.4 结语
1.3 本研究解决的问题
第二章 猪瘟病毒的分离鉴定
2.1 实验材料
2.1.1 疑似猪瘟病料
2.1.2 病毒与细胞
2.1.3 质粒和菌种
2.1.4 实验中用到的引物
2.1.5 试验动物
2.1.6 试剂
2.2 试验方法
2.2.1 病料采集与处理
2.2.2 兔体交互免疫试验
2.2.3 细胞培养传代试验
2.2.4 间接荧光抗体试验
2.2.5 猪瘟病毒的RT-PCR检测
2.2.6 cDNA的克隆与鉴定
2.2.7 序列测定
2.3 结果
2.3.1 兔体交互免疫试验
2.3.2 细胞培养传代试验
2.3.3 间接荧光抗体试验
2.3.4 猪瘟病毒的RT-PCR扩增
2.3.5 cDNA的克隆和鉴定
2.3.6 现地分离株NS基因片段序列的核苷酸及推导氨基酸序列分析
2.4 讨论
第三章 猪瘟病毒E2基因序列分析
3.1 材料
3.1.1 疑似猪瘟病料
3.1.2 病毒与细胞
3.1.3 质粒和菌种
3.1.4 实验中用到的引物
3.2 方法
3.2.1 反转录和RT-PCR
3.2.2 猪瘟病毒E2基因部分片段的克隆
3.2.3 序列测定
3.2.4 序列比较分析
3.2.5 遗传进化分析
3.3 结果
3.3.1 E2基因的克隆和鉴定
3.3.2 猪瘟E2基因部分编码序列的核苷酸序列分析
3.3.3 推导的E2基因部分氨基酸序列分析
3.3.4 E2基因部分编码序列的核苷酸及推导氨基酸序列的同源性比较
3.3.5 遗传进化分析
3.4 讨论
第四章 猪瘟病毒基因芯片诊断方法的建立
4.1 材料
4.1.1 病毒
4.1.2 细胞
4.1.3 试剂
4.1.4 仪器
4.2 方法
4.2.1 靶探针的设计与合成
4.2.2 靶DNA探针的制备
4.2.3 DNA芯片的制备
4.2.4 样品标记
4.2.5 杂交
4.2.6 芯片的洗涤
4.2.7 图像采集
4.2.8 芯片鉴定
4.3 结果
4.3.1 靶探针的制备
4.3.2 DNA芯片的制备
4.3.3 杂交与扫描
4.4 讨论
4.4.1 芯片类型的选择
4.4.2 点样方式的选择
4.4.3 杂交反应
4.4.4 样品的处理
4.4.5 杂交信号的检测
4.4.6 小结
第五章 基因芯片诊断技术相关实验研究及初步应用
5.1 材料
5.1.1 病毒
5.1.2 细胞
5.1.3 实验用引物的设计与合成
5.1.4 试剂和仪器
5.2 方法
5.2.1 靶探针浓度的测定
5.2.2 特异性试验
5.2.3 敏感性试验
5.2.4 现地应用实验
5.2.5 比较试验
5.3 结果
5.3.1 靶探针浓度的测定
5.3.2 特异性试验
5.3.3 敏感性试验
5.3.4 现地应用实验
5.3.5 比较试验
5.4 讨论
5.4.1 猪瘟诊断方法的比较
5.4.2 反应条件的影响
5.4.3 需要注意的问题
5.4.4 小结
第六章 结论与创新点
参考文献
致谢
个人简介
发布时间: 2005-07-18
参考文献
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