禾谷镰刀菌随机插入突变体库的构建与分析

论文摘要

禾谷镰刀菌引起的赤霉病（Fusarium head blight, FHB）是禾谷类作物的一种重要病害,广泛分布于世界各温暖潮湿地区,危害小麦、大麦、燕麦、玉米、水稻、黑麦等多种禾谷类作物。赤霉病不仅导致作物减产,其病原菌还会产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮等多种毒素,食用后可引起呕吐、腹痛、头昏等多种中毒症状,严重威胁着人和动物的健康。随着禾谷镰刀菌全基因组测序的完成,研究禾谷镰刀菌的基因功能,了解禾谷镰刀菌的致病机理,成为赤霉病防治的一个有效的途径。而建立一个随机插入突变体库,可以更有利于分离和鉴定禾谷镰刀菌生长、发育、致病相关的基因。限制性内切酶介导整合（REMI）的方法是Schiestl和Petes在研究酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）时首先建立起来的。近年来,REMI技术以其转化效率高、单拷贝插入概率大、易于分离突变基因等优点,在突变体库的建立、基因标记等方面得到了广泛的应用。目前,该方法已广泛应用于酵母、丝状真菌以及动物的研究中本研究对禾谷镰刀菌的原生质体制备、纯化和限制酶介导的转化体系进行了摸索和优化,建立了一套有效的REMI转化方法。经过多次实验,构建了禾谷镰刀菌的突变体库,共得到具有潮霉素B抗性的转化子2300多个,并进一步对突变体库进行了PCR鉴定、Southern分析和转化子表型、致病力分析。优化后的转化效率为普通原生质体转化的2-3倍,最高转化效率为每个转化可得到68个转化子；对其中15个转化子进行PCR鉴定,均为带有潮霉素B编码基因的阳性转化子；对部分转化子进行Southern杂交分析发现,得到转化子的单拷贝插入概率为66.7%,比普通原生质体转化的单拷贝概率高23.9%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1 前言
• 1.1 禾谷镰刀菌介绍
• 1.1.1 禾谷镰刀菌生物学特征
• 1.1.2 小麦赤霉病
• 1.1.3 镰刀菌毒素
• 1.2 禾谷镰刀菌功能基因组学研究进展
• 1.3 限制酶介导整合（REMI）技术
• 1.3.1 转化方法介绍
• 1.3.2 REMI的原理和要求
• 1.3.3 REM1的发展和应用
• 1.4 研究的目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 供试菌株与转化载体
• 2.1.2 实验作物品种
• 2.1.3 实验仪器
• 2.1.4 酶及其他主要试剂
• 2.1.5 培养基及试剂配方
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 质粒提取
• 2.2.2 转化载体的线性化及过柱回收
• 2.2.3 崩溃酶（Driselase）的配制
• 2.2.4 原生质体的制备
• 2.2.5 限制酶介导的转化（REMI）及转化方法优化
• 2.2.6 突变体库的建立及鉴定
• 2.2.7 转化子的分析
• 3 结果与分析
• 3.1 转化载体的提取及线性化
• 3.2 原生质体制备及制备条件优化
• 3.2.1 孢子的制备
• 3.2.2 缓冲液对原生质体形成的影响
• 3.2.3 细胞壁裂解酶种类对原生质体形成的影响
• 3.2.4 孢子萌发时间对原生质体形成的影响
• 3.2.5 纯化方法探索
• 3.2.6 再生培养基的选择
• 3.3 REMI转化方法优化
• 3.3.1 限制酶浓度对转化效率的影响
• 3.3.2 DNA浓度对转化效率的影响
• 3.3.3 载体线性化对转化效率的影响
• 3.3.4 载体线性化后纯化对转化效率的影响
• 3.3.5 倒平板前冰浴对转化效率的影响
• 3.4 突变体库质量鉴定
• 3.4.1 基因组DNA提取
• 3.4.2 PCR鉴定
• 3.4.3 Southern分析
• 3.5 转化子分析
• 3.5.1 表型筛选及分析
• 3.5.2 生长速度测定
• 3.5.3 田间接种
• 4 讨论
• 4.1 原生质体的制备及纯化
• 4.2 突变体库的建立和鉴定
• 4.3 转化子的筛选与分析
• 参考文献
• 致谢