咖啡酸锗抗肿瘤活性与机制研究

论文摘要

背景:恶性肿瘤严重危害人类健康,宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一,居女性生殖系统恶性肿瘤的50%以上,病死率居妇女恶性肿瘤的首位。调查发现其发病率呈每年上升及年轻化趋势。药物治疗是目前临床治疗恶性肿瘤的主要手段之一。寻找和研发高效低毒的化疗药物,是当代化学和医学领域的重要研究课题。有机锗化合物是具有抗癌活性的金属化合物之一,因其广谱的抗癌作用,独特的生理活性,极低的毒性而日益受到人们的重视。目的:研究咖啡酸锗对荷瘤小鼠的实验治疗作用及体外抗肿瘤活性,从细胞、亚细胞水平探讨其抗肿瘤作用机制,并考察咖啡酸锗的急性毒性,为咖啡酸锗作为新型化疗药物的开发和应用提供实验依据。方法:建立小鼠皮下移植瘤模型,观察咖啡酸锗对小鼠U14宫颈癌和小鼠H22肝癌的实验治疗作用;以HE染色、MG-P染色和透射电镜的方法观察咖啡酸锗诱导小鼠移植瘤细胞凋亡的作用;应用流式细胞术检测咖啡酸锗作用后肿瘤组织的细胞凋亡率和分析细胞周期改变;采用免疫组化方法,观察药物作用后小鼠移植瘤组织中bax和bcl-2蛋白表达情况;采用MTT法评价咖啡酸锗体外抑制U14和H22肿瘤细胞活性;观察咖啡酸锗对小鼠的急性毒性。结果:1、对荷瘤小鼠的抗肿瘤实验结果提示,咖啡酸锗对宫颈癌U14有很好的实验治疗作用:连续给药10天后,0.5 mg/kg、1 mg/kg和2 mg/kg剂量组的抑瘤率分别为38.5%、47.2%和64.0%,瘤重与阴性对照组比较均有显著性差异（P＜0.01）。咖啡酸锗对肝癌H22亦有显著的体内抗肿瘤作用,0.5 mg/kg、1 mg/kg和2 mg/kg剂量组的抑瘤率分别为37.4%、47.2%和64.0%,瘤重均明显小于阴性对照组（P＜0.01）。MTT法实验结果表明:咖啡酸锗对体外培养的U14细胞和H22细胞增殖均有一定程度的抑制作用,对48小时后的U14细胞的IC50值为48.57μg/ml。2、咖啡酸锗对U14荷瘤小鼠、H22荷瘤小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响,与阴性对照组比较,均无明显差异（P＞0.05）,体重无明显下降（P＞0.05）。相对于化疗药物环磷酰胺对机体出现的严重免疫抑制作用,咖啡酸锗体现出一定优势。3、HE染色、MG-P染色组织病理学及电镜观察可见,咖啡酸锗组出现较多的凋亡细胞（P＜0.05）,可见细胞皱缩变小,胞浆致密,核固缩,染色质浓集、边聚、胞质空泡化等细胞凋亡的形态学特征。4、流式细胞术检测结果表明,咖啡酸锗能诱导U14肿瘤细胞凋亡,在G0～G1前出现一个明显的凋亡峰,细胞周期被阻滞在S期。5、免疫组化实验结果表明,咖啡酸锗诱导细胞凋亡是通过影响促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的表达来实现的。咖啡酸锗使U14和H22细胞bcl-2蛋白表达下调,bax蛋白表达上调。6、急性毒性实验表明,咖啡酸锗对小鼠无明显急性毒性,最大耐受量为8g/kg。结论:咖啡酸锗在体内外均能有效抑制小鼠U14宫颈癌、小鼠H22肝癌的生长,且无免疫抑制作用,无明显急性毒性。咖啡酸锗可明显上调U14和H22细胞中bax蛋白的表达,下调bcl-2蛋白的表达,进而促进肿瘤细胞凋亡,可能是其发挥抗肿瘤作用的机制之一。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分 咖啡酸锗抗肿瘤作用的药效学研究
• 1 引言
• 2 材料与仪器
• 2.1 实验动物
• 2.2 细胞株
• 2.3 药物
• 2.4 试剂
• 2.5 仪器
• 3 方法
• 3.1 荷瘤模型的建立
• 3.2 咖啡酸锗体内抑瘤活性实验
• 3.3 MTT法测定咖啡酸锗体外抑瘤活性实验
• 4 结果
• 4.1 咖啡酸锗对小鼠U14移植瘤的抑瘤作用
• 4.2 咖啡酸锗对小鼠H22移植瘤的抑瘤作用
• 4.3 咖啡酸锗对荷瘤小鼠免疫器官的影响
• 4.4 咖啡酸锗体外抑瘤活性
• 5 讨论
• 第二部分 咖啡酸锗抗肿瘤机制研究
• 1 引言
• 2 材料与仪器
• 2.1 试剂
• 2.2 仪器
• 3 方法
• 3.1 苏木素-伊红（HE）染色观察
• 3.2 组织化学（甲基绿-派洛宁）染色观察
• 3.3 透射电镜观察
• 3.4 流式细胞术检测
• 4 结果
• 4.1 HE染色分析咖啡酸锗作用U14、H22移植瘤后的细胞形态学特征
• 4.2 MG-P染色分析咖啡酸锗作用U14、H22移植瘤后的细胞形态学特征
• 4.3 电镜观察U14、H22肿瘤细胞凋亡形态学特征
• 4.4 流式细胞术检测咖啡酸锗对U14肿瘤细胞周期及凋亡率的影响
• 5 讨论
• 第三部分 咖啡酸锗对凋亡相关蛋白影响的研究
• 1 引言
• 2 材料与仪器
• 2.1 试剂
• 2.2 仪器
• 3 方法
• 3.1 载玻片的处理
• 3.2 免疫组化SP法步骤
• 3.3 染色结果判定
• 4 结果
• 4.1 咖啡酸锗对U14肿瘤组织的免疫组化实验结果
• 4.2 咖啡酸锗对H22肿瘤组织的免疫组化实验结果
• 5 讨论
• 第四部分 咖啡酸锗急性毒性试验
• 1 引言
• 2 材料与仪器
• 2.1 实验动物
• 2.2 药物
• 2.3 仪器
• 3 方法
• 3.1 预试验
• 3.2 最大耐受量（MTD）试验
• 4 结果
• 4.1 一般症状及死亡情况
• 4.2 体重变化及脏器重量情况
• 4.3 液生化检查结果
• 4.4 脏器HE染色观察结果
• 5 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 攻读学位期间发表的论文
• 致谢