棉铃虫感觉神经元膜蛋白和G蛋白α亚基基因克隆表达及其相互作用蛋白的筛选

论文摘要

棉铃虫是许多国家农业上的重要害虫。研究表明,昆虫的嗅觉在处理来自环境的化学信号过程中起着非常重要的作用,从而使昆虫能够觅食,寻找配偶、产卵场所、寄主和猎物,及发现捕食者等。昆虫的气味识别过程非常复杂,有多种蛋白参与。迄今为止,昆虫的嗅觉识别机制研究取得了一些可喜的进展,但是对整个嗅觉信号传导途径了解得非常少。清楚阐明昆虫的嗅觉信号传导会为研制高效的引诱剂或杀虫剂提供理论依据,为有效防治棉铃虫提供新的思路与途径,延缓或降低棉铃虫对Bt棉花抗性演化的速度。本文利用RACE技术结合PCR克隆了Gq蛋白α亚基基因;采用半定量RT-PCR研究了Gq α和SNMP的两个基因在棉铃虫体内的时空表达情况;对两个基因进行原核表达和纯化;利用酵母双杂交技术研究已经克隆的Gq α和SNMP是否互作,并筛选与Gq α相互作用的蛋白。本研究所取得的结果如下: （1）利用PCR结合RACE技术从棉铃虫触角中首次克隆了G蛋白α亚基基因,经过BLAST搜索同源序列发现其属于G蛋白α亚基的q家族。已被GenBank数据库收录,登录号AY957405,命名为Gq a Harm。Gq α Harm与已报道的昆虫和其他无脊椎动物的Gq蛋白α亚基相似性在90%以上。与近缘种甘蓝夜蛾Mamestra brassicae Gq α的相似性高达96.88%;与家蚕Bomyx mori Gq α的相似性高达97.73%;与果蝇（Drosophila melanogaster）Gq α的相似性高达89.52%;与线虫Caenorhabditis elegansGq α的相似性高达81.69%;与加勒比龙虾Panulirus argus Gq α的相似性高达87.25%。 （2）半定量RT-PCR研究表明,Gq α Harm在棉铃虫雌雄成虫触角中表达,在头、胸、腹、足和翅中也有表达,并且表达量差异不显著;此外,在喙、下颚须和下唇须中也有表达;在卵、幼虫、蛹和成虫体内也都有表达;在卵中的表达量最高,而在成虫中的表达量最低,在幼虫和蛹的前、中、后期的表达量差异不大。研究表明Gq α Harm是一种普遍存在的蛋白。棉铃虫Gq α Harm的这种组织分布广泛性,可能预示其参与细胞的多种信号传导途径。 （3）棉铃虫感觉神经元膜蛋白基因序列法国人已经报道（Jacquin-Joly,E.andFrancois,M.-C.,2003 GenBanK,AF462067）。利用特异性引物从本实验室棉铃虫触角中克隆了一条全长1690bp的cDNA序列,感觉神经元膜蛋白（SNMP）阅读框全长1572bp,编码523个氨基酸残基,序列中有2个跨膜区,具有昆虫感觉神经元膜蛋白的典型特征。SNMP与已报道的其它昆虫的感觉神经元蛋白的氨基酸序列有很高的相似性。半定量RT-PCR研究结果显示,SNMP在棉铃虫中不仅在触角中表达,也在去掉触角的头、足中表达。但是在触角中的表达量最高,在雌雄触角中的表达量差异不显著。在棉铃虫的味觉器官如:喙,下颚须和下唇须中也有表达。在卵、蛹和成虫体内也都有表达,在卵中表达量相对较低。SNMP在棉铃虫体内的时空表达情况表明:SNMP不仅参与棉铃虫的嗅觉识别,而且还参与棉铃虫的味觉识别。

论文目录

• 第一章 绪论
• 1.1 气味结合蛋白研究进展
• 1.2 昆虫触角气味受体的研究进展
• 1.3 感觉神经元膜蛋白（SNMP）的研究进展
• 1.3.1 SNMP的生化特性：
• 1.3.2 SNMP的分布及时空表达情况：
• 1.3.3 SNMP的生理作用：
• 1.4 昆虫触角G蛋白的研究进展
• 1.4.1 G蛋白的基本结构和种类
• 1.4.2 G蛋白的调控循环
• 1.4.3 G蛋白α亚基
• 1.4.4 昆虫G蛋白信号途径的研究进展
• 1.5 酵母双杂交简介
• 1.5.1 酵母双杂交系统的基本原理
• 1.5.2 酵母双杂交系统的特点及优点
• 1.5.3 酵母双杂交系统的应用
• 1.5.4 酵母双杂交系统的缺陷
• 1.5.6 酵母双杂交系统的拓展
• 1.6 研究的背景和意义
• 第二章 棉铃虫GQα亚基及SNMP的基因克隆与组织分布
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 供试昆虫
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 仪器设备
• 2.1.5 试验技术路线
• 2.1.6 总RNA的提取
• 2.1.7 cDNA的合成
• 2.1.8 引物的设计
• 2.1.9 RT-PCR反应
• 2.1.10 Gq 5'-RACE反应
• 2.1.11 Gq 3'-RACE反应
• 2.1.12 PCR和RACE产物的回收纯化
• 2.1.13 连接反应
• 2.1.14 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.1.15 转化大肠杆菌
• 2.1.16 质粒DNA的小量提取
• 2.1.17 阳性克隆鉴定
• 2.1.18 序列测定
• 2.1.19 棉铃虫G蛋白α亚基及SNMP的时空表达
• 2.1.20 实验室不同品系棉铃虫中肠G蛋白α亚基基因变异情况
• 2.1.21 G蛋白α亚基基因内含子情况
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 G蛋白α亚基基因克隆及序列分析
• 2.2.2 α亚基在不同组织及各虫期的转录水平
• 2.2.3 SNMP的基因克隆及序列分析
• 2.2.4 棉铃虫SNMP在不同组织及各虫期的转录水平
• 2.2.5 实验室不同品系棉铃虫中肠G蛋白α亚基蛋白变异情况
• 2.2.6 G蛋白α亚基基因内含子情况
• 2.3 讨论
• 2.3.1 对克隆的棉铃虫Gqα和SNMP的基因及其时空表达情况的分析
• 2.3.2 关于半定量RT-PCR方法的探讨
• 2.3.3 关于RACE技术的探讨
• 第三章 棉铃虫Gα及SNMP的原核表达及纯化
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌种和质粒
• 3.1.2 主要化学试剂
• 3.1.3 主要仪器设备
• 3.1.4 储存液和主要试剂配方
• 3.1.5 引物设计
• 3.1.6 融合表达载体的构建
• 3.1.7 连接产物的转化、鉴定
• 3.1.8 细胞培养和诱导表达
• 3.1.9 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
• 3.1.10 Gqα基因的融合表达
• 3.1.11 包涵体的破碎和重折叠
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 G蛋白α亚基和SNMP融合表达载体的构建
• 3.2.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
• 3.3 讨论
• 第四章 酵母双杂交筛选与GQα及SNMP作用的蛋白
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 试剂
• 4.1.3 技术路线
• 4.1.4 分别用棉铃虫Gqα和SNMP构建诱饵蛋白
• 4.1.5 构建cDNA文库
• 4.1.6 用构建好的诱饵蛋白筛选cDNA文库
• 4.1.7 酵母共转化法研究克隆的Gα和SNMP之间的互作
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 诱饵蛋白的构建
• 4.2.2 cDNA文库的构建
• 4.2.3 用棉铃虫G蛋白α亚基做诱饵蛋白筛选cDNA文库的结果
• 4.2.4 酵母双杂交研究克隆的G蛋白α亚基与SNMP之间的互作关系
• 4.3 讨论
• 4.3.1 对酵母双杂交实验结果的讨论
• 4.3.2 酵母双杂交试验常见问题
• 4.3.3 下一步工作计划
• 第五章 结论
• 参考文献
• 作者简历
• 致谢