论文摘要
分子,是MAPK级联信号通路中关键分子,在其它信号通路中也发挥作用。这些信号通路通过Raf-1相互作用构成一个复杂的信号网络,参与肿瘤的生长、增殖、凋亡、细胞周期等肿瘤发生发展的多个重要环节,抑制Raf-1可抑制肿瘤细胞生长。Raf-1激酶还可以参与多个不同的信号途径来抵抗内皮细胞凋亡。因此,在肿瘤血管生成过程中,Raf-1可能参与了多个促血管生成因子的作用过程,其活性的上调可能与肿瘤血管生成相关。【目的】1.观察Raf-1对血管内皮细胞的生长、细胞周期、细胞凋亡及血管生成等的影响;2.检测乳腺癌细胞系中Raf-1内源性表达的差别并观察其与诱导肿瘤血管生成能力的相关性;3.观察Raf-1过表达对肿瘤细胞诱导血管生成能力的影响,并检测特异性干扰Raf-1表达后该能力的变化情况。【方法】1.自新鲜脐带获得人静脉内皮细胞进行原代培养;根据raf-1基因序列化学合成siRNA;构建干扰载体pSilencer3.1-H1-Raf-1;2.将pCDNA3-raf-1-flag、Raf-1 siRNA瞬时转染HUVECs;将真核表达载体pCDNA3-raf-1-flag、干扰载体pSilencer3.1-H1-Raf-1转染MCF-7细胞,筛选出稳定转染的单克隆细胞;3.应用Western blot、RT-PCR检测实验用所有细胞中总Raf-1,磷酸化Raf-1以及Raf-1 mRNA的水平;4.应用MTT法检测以下各组血管内皮细胞的生长曲线:①瞬时转染pCDNA3-raf-1-flag、Raf-1 siRNA的HUVECs;②4种乳腺癌细胞条件培养上清处理的HUVECs;③表达不同Raf-1水平的MCF-7细胞条件培养上清处理的HUVECs;5.应用流式细胞仪检测瞬时转染pCDNA3-raf-1-flag、Raf-1 siRNA的HUVECs细胞周期及细胞凋亡;6.应用ELISA检测各组乳腺癌细胞培养上清中的VEGF浓度;7.体外血管形成实验检测步骤4中所有HUVECs的血管形成能力;8.进行各组乳腺癌细胞裸鼠成瘤实验,观察肿瘤生长;进行移植瘤Raf-1及CD34免疫组化染色,观察二者之间的相关性。【结果】1.利用真核表达载体pCDNA3.0-Raf-1-flag转染HUVECs,Raf-1的mRNA、总蛋白表达水平及磷酸化水平较对照组明显增高,HUVECs增殖速度加快,进入S期细胞比例增加,凋亡比例减少,血管形成能力提高;2.转染Raf-1 siRNA的HUVECs中,Raf-1的mRNA、总蛋白表达水平及磷酸化水平较对照组均明显降低,HUVECs的生长速度明显减慢,细胞周期阻滞于G1期,凋亡比例较对照组明显增多,管形成能力明显减弱;3.乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231、Bcap-37细胞系内源性Raf-1表达水平及磷酸化水平没有明显差异;而SK-Br-3的Raf-1表达水平及磷酸化水平低于其它3组;4.SK-Br-3培养上清中的VEGF浓度低于MCF-7、MDA-MB-231、Bcap-37细胞培养上清中浓度;5.体外,应用SK-Br-3条件培养上清诱导HUVECs的小管形成能力也弱于MCF-7细胞培养上清的诱导能力;体内,应用裸鼠成瘤实验也显示SK-Br-3移植瘤的微血管密度也低于MCF-7移植瘤;6.稳定转染过表达载体pCDNA3.0-Raf-1-flag的MCF-7细胞,Raf-1的mRNA、蛋白表达水平明显增高,培养上清中的VEGF浓度也增加,体外诱导HUVECs小管形成能力增强;相应在裸鼠成瘤实验中,过表达Raf-1d的MCF-7移植瘤中微血管密度增加;7.稳定转染干扰载体pSilencer3.1-H1-Raf-1的MCF-7乳腺癌细胞,Raf-1的mRNA、蛋白表达水平明显减低,培养上清中的VEGF浓度也减少,体外诱导HUVECs小管形成能力减弱;相应在裸鼠成瘤实验中,MCF-7细胞封闭Raf-1表达可降低肿瘤微血管密度,抑制瘤体生长。【结论】血管内皮细胞内Raf-1的水平与血管内皮细胞的增殖、细胞周期以及血管生成能力呈正相关,而与细胞凋亡比例呈负相关;肿瘤细胞内的Raf-1水平影响VEGF的水平,进而影响诱导血管内皮细胞的增殖以及血管生成能力;过表达Raf-1的肿瘤细胞诱导肿瘤血管生成的能力增强;利用RNAi技术特异性抑制血管内皮细胞及肿瘤细胞Raf-1表达,可以抑制肿瘤血管生成,为乳腺癌抗血管治疗奠定一定的实验基础。
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