多巴胺醌在帕金森病发病过程中的作用研究

论文摘要

帕金森病（Parkinson’s disease, PD）是年龄相关性神经系统退行性疾病,主要特征是中脑黑质区多巴胺能神经元特异性缺失。之前的研究表明多巴胺氧化在帕金森病发病过程中起重要作用。多巴胺在氧化过程中通过氧化还原反应可产生多巴胺醌和活性氧,多巴胺醌能和含有半胱氨酸巯基的蛋白质结合生成醌化蛋白,活性氧可能造成细胞内脂质、蛋白质等物质的氧化损伤。本实验探索了大鼠幼龄到老龄不同年龄段内四个不同脑区醌化蛋白及脂质氧化含量的表达变化。为了进一步确定醌化蛋白的生成与多巴胺能神经元特异性缺失之间的关系,我们进一步在细胞模型上检测了神经毒性药物多巴胺、鱼藤酮对人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的毒性作用,分别检测了细胞活性与醌化蛋白形成量及脂质氧化水平之间的相关性。实验证实了醌化蛋白的形成在帕金森病发病过程中对多巴胺能神经元特异性缺失起着重要作用。具体实验结果如下：1.NBT/Glycine法检测醌化蛋白方法的确立及多巴胺自氧化检测。运用分光光度计检测法及蛋白印迹/NBT显色法检测了多巴胺自氧化及氯化硝基四氮唑蓝（nitroblue tetrazolium, NBT）/甘氨酸（Glycine）法检测醌化蛋白的能力。结果显示游离多巴胺具有自氧化现象,其氧化产物与蛋白具有特异性结合的能力。NBT/Glycine法可以对多巴胺醌及醌化蛋白含量进行检测,该方法具有较高的稳定性和特异性。2.大鼠老龄化过程中不同脑区醌化蛋白及脂质氧化含量的变化研究。分离幼龄到老龄（2-,6-,10-,15-月龄）不同年龄段四个不同脑区（前额叶皮层,海马,尾状核,黑质）脑组织样品,运用分光光度计及蛋白印迹/NBT显色法分别检测了每组样品中酣化蛋白含量随年龄增长的变化,通过丙二醛（Malondialdehyde, MDA）含量变化的检测,研究了不同样品中脂质氧化情况随年龄增长的变化,运用双向电泳（Two Dimensional electrophoresis,2-DE）技术及蛋白印迹/NBT显色法分离出易于被多巴胺醌修饰的靶蛋白。结果显示海马脑区没有检测到醌化蛋白含量随年龄增长而显著性增加,前额叶皮层和纹状体内醌化蛋白含量随年龄增长有微小但显著的差异,而黑质区醌化蛋白含量增加最为显著,和2-月龄组比较,黑质脑区醌化蛋白含量在15-月龄组增加了约50%,同时双向电泳及蛋白印迹/NBT显色法检测出15-月龄黑质区含有更多的醌化蛋白点。脑组织样品四个脑区均未检测到脂质氧化水平随年龄增长而有显著性差异。以上结果表明,黑质区醌化蛋白的含量变化具有显著的年龄相关性,醌化蛋白的形成可能对帕金森病发病过程中多巴胺能神经元选择性缺失起着至关重要作用。3.多巴胺、鱼藤酮对细胞毒性作用的研究为了进一步验证醌化蛋白的形成与多巴胺引起的细胞毒性之间的相关性,我们进行了多巴胺对神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的毒性实验。运用MTT（3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium-bromide, MTT）比色法和活细胞计数法检测不同药物多巴胺、鱼藤酮对SH-SY5Y细胞活性的影响,运用MTT比色法检测二相酶诱导剂萝卜硫素（Sulforaphane, SF）对多巴胺诱导的细胞毒性的保护作用,通过NBT/Glycine法及MDA检测法探索多巴胺、鱼藤酮抑制细胞活性的作用机制。结果显示多巴胺作用SH-SY5Y细胞24h可导致细胞活性显著性降低,并具有多巴胺浓度依赖性,同时上清和沉淀样品醌化蛋白含量随多巴胺浓度的增加而增多,且沉淀部分中醌化蛋白的含量增长最为显著。1μmol/LSF预作用细胞24h可显著抑制多巴胺诱导的SH-SY5Y细胞毒性作用,细胞存活率上升,同时细胞上清和沉淀样品中醌化蛋白含量降低。MDA检测结果显示在多巴胺浓度0-400μmol/L的范围内未检测到脂质氧化水平的显著性变化。鱼藤酮浓度在1000nmol/L时细胞活性出现显著性降低,同时上清样品醌化蛋白含量随鱼藤酮浓度的增加而减少,沉淀样品中醌化蛋白含量随鱼藤酮浓度的增加而增多。MDA检测在鱼藤酮浓度0～1000 nmol/L范围内检测到脂质氧化含量有显著增多,且具有浓度依赖性。帕金森病是年龄相关性神经系统退行性疾病,研究表明多巴胺氧化在帕金森病发病过程中起重要作用。本实验对多巴胺的两个氧化产物,活性氧和多巴胺醌分别进行了研究,结果表明与活性氧的作用相比,醌化蛋白的形成与细胞毒性之间存在更为显著的相关性,证实了醌化蛋白的形成在帕金森病发病过程中对多巴胺能神经元特异性缺失起着重要作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 多巴胺自氧化及NBT/Glycine法检测醌化蛋白方法的确立
• 前言
• 1. 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2. 实验结果
• 2.1 多巴胺自氧化现象检测
• 2.2 多巴胺醌与脑组织蛋白中特异蛋白的结合
• 2.3 NBT/Glycine法检测猪肾二胺氧化酶
• 3. 讨论
• 第二章 大鼠老龄化过程中不同脑区醌化蛋白含量的变化研究
• 前言
• 1. 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2. 结果
• 2.1 不同脑区内醌化蛋白含量随年龄增长的变化研究
• 2.2 不同脑区内脂质氧化含量随年龄增长的变化研究
• 3. 讨论
• 第三章 多巴胺、鱼藤酮对细胞毒性作用的研究
• 前言
• 1. 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2. 结果
• 2.1 多巴胺对细胞活性的影响
• 2.2 多巴胺对细胞活性影响的可能机理
• 2.3 萝卜瘤素抵制多巴胺引起的细胞毒性研究
• 2.4 鱼藤酮对细胞活性的影响
• 2.5 鱼藤酮对细胞活性影响的可能机理
• 3. 讨论
• 3.1 多巴胺对细胞毒性的研究
• 3.2 鱼藤酮对细胞毒性的研究
• 综述 帕金森病发病机理及帕金森病相关蛋白质组学研究进展
• 1. 帕金森病发病机理研究
• 2. 帕金森病相关蛋白质组学的研究
• 参考文献
• 附录
• 致谢