论文摘要
DNA是储存与传递遗传信息的重要生物大分子，其分子的完整性对生物体生命活动至关重要。过量的紫外辐射可引起细胞内DNA碱基发生突变、DNA断裂、DNA-DNA交联、DNA-蛋白交联以及染色体畸变等损伤。DNA损伤若不能及时修复，细胞将发生癌变或死亡。不同剂量紫外线对细胞DNA的损伤模式不同，可能引起的修复机制有差别。因此，研究不同剂量紫外线诱导细胞DNA损伤模式的变化对于进一步探讨DNA损伤修复机制，预防某些修复缺陷性疾病的发生有一定的现实意义，并对遗传学、肿瘤学、衰老学和毒理学等研究具有一定的理论价值。本文采用彗星电泳法检测紫外线对细胞DNA损伤的效应以及不同种类细胞的敏感性差异；应用彗星电泳、DCFH-DA荧光探针检测法以及NAC抗氧化剂等方法检测了低剂量紫外线对细胞DNA的损伤；采用流式细胞仪、MTT、细胞计数等方法检测了中等剂量UVC对细胞DNA的损伤；应用原子力显微镜和彗星电泳方法检测了高剂量紫外线对细胞DNA的损伤。主要内容：1、检测相同剂量不同功率紫外线诱导的细胞DNA损伤。彗星电泳和HE染色的实验结果表明：离体培养的K562细胞和原代培养的小鼠肝细胞经不同功率相同剂量的UVC或UVB照射后，DNA损伤程度无差异。2、检测不同波长UV照射白血病K562细胞DNA的损伤。彗星电泳的检测结果显示：照射剂量0-440 J／m2的UVA不会对K562细胞DNA造成即时性损伤；UVB、UVC可以造成K562细胞DNA的损伤，并在一定范围内呈现照射剂量依赖效应。UVB在20～320 J／m2照射剂量下与细胞DNA损伤的相关性为0．9344和0．956：UVC在3．2～180 J／m2照射剂量下与细胞DNA损伤的相关性为0．9841和0．994：相同照射剂量下UVC对细胞DNA的损伤程度显著高于UVB。3、检测了不同细胞对UVC的敏感性。不同肿瘤细胞应答UVC损伤的敏感性存在差异：SMMC-7721细胞的敏感性高于HepG2细胞。正常细胞与肿瘤细胞应答UVC损伤的敏感性也存在差异：hepa1-6细胞的敏感性高于原代培养的小鼠肝细胞。不同活化程度的正常细胞对UVC损伤的敏感性不同：活化淋巴细胞比静息淋巴细胞敏感性高。4、检测了不同周期时相的K562细胞对于UVC的敏感性：彗星检测发现G2期的细胞最为敏感，其次为M期、S期和G1期。5、K562细胞和原代培养的小鼠肝细胞在低剂量UVB和UVC照射后经孵育，彗星电泳能够检测出即时检测不能发现的细胞DNA损伤。低剂量UV照射后，胞内ROS含量升高，并在细胞孵育后含量降低。实验组中加入ROS清除剂NAC后可以降低细胞DNA的损伤。这提示低剂量UV照射造成的延时损伤可能以ROS引发的损伤修复有关。6、K562细胞经中等剂量（60 J／m2）UVC照射后的DNA损伤在20h内修复或消失。UVC致细胞DNA损伤具有延时效应。UVC照射细胞后，随孵育时间的延长细胞DNA损伤程度加剧，2小时后DNA损伤达到最大值，孵育4小时后DNA损伤程度开始下降，孵育至20小时损伤程度恢复至未照射细胞的水平。细胞计数的结果表明，照射后12h细胞数目降至最低，而后细胞数目丌始增加。UVC照射使K562细胞周期被阻滞于G1／S期或G2／M期。7、优化了用于原子力显微镜观察的细胞DNA提取系统。建立了用原子力显微镜观察DNA的阳性模型。8、K562细胞经高剂量UV照射后的DNA损伤严重。高剂量UVC照射后，K562细胞DNA损伤严重，发生断裂、交联（DNA链间或链内），K562细胞增殖能力减弱。高剂量UVB照射后，DNA小片段交联在一起。结论：相同剂量不同功率的UVC或UVB照射后，DNA损伤程度无差异。UV造成的细胞DNA损伤与照射波段、剂量密切相关。UVC对细胞DNA的损伤能力大于UVB。UVB、UVC造成的K562细胞DNA的损伤在一定范围内呈现照射剂量依赖效应。我们得到UVB、UVC在一定剂量范围与DNA损伤之间的线性方程。UBV：y=0．1196x-0．0534，R2=0．9344或y=0．0814x-0．0627，R2=0．956。UVC：y=0．2018x+0．9053，R2=0．9841或y=0．1251x+0．6914，R2=0．994。不同细胞应答UVC损伤的敏感性存在差异，这可能与细胞的增殖速度不同有关；周期时相的细胞对UVC的敏感性不同进一步证明了这一点。不同剂量紫外线诱导的细胞DNA损伤有不同的模式。实验发现低剂量UVB与UVC照射K562细胞和原代培养的小鼠肝细胞后经孵育，彗星电泳能够检测出即时检测不能发现的细胞DNA损伤并且细胞内ROS含量升高，进一步实验加入ROS清除剂NAC后可以降低细胞DNA的损伤，表明延时检测到的DNA损伤与ROS有一定关系。中等剂量UVC对K562细胞DNA的损伤具有延时效应并且在20小时内可以恢复。此剂量下的UVC照射后细胞周期被阻滞在G1／S期或G2／M期。应用原子力显微镜直接观测到高剂量UVC照射细胞后，K562细胞DNA损伤严重，发生断裂、交联。与UVB相比，UVC照射后细胞DNA链的直径变细，DNA链的交联可能多为链间交联。