论文摘要
稻瘟病是一种严重危害水稻的毁灭性病害，其病原菌为子囊菌Magnaporthe grisea。稻瘟病菌也是一种研究病原真菌-寄主植物相互作用的模式生物。研究稻瘟病菌致病的分子机理不仅对于了解病原真菌-寄主的互作机理，而且对于开发新的杀菌剂具有重要的促进作用。稻瘟病菌致病相关基因的克隆和功能分析是研究稻瘟病菌致病机制的一种快速且有效的途径。非组蛋白基因6（mnh6）和Ⅲ型膜整合蛋白（mtp1）是稻瘟病菌的两个功能未知的基因。目前为止，还没有在稻瘟病菌或其他丝状真菌中研究过mnh6和mtp1基因或其同源基因的功能。本文克隆了mnh6和mtp1基因，通过DNA同源置换分别敲除了这2个基因，并分析了基因缺失引起的稻瘟病菌表型和致病性变化，确定了这2个基因在稻瘟病菌生长、发育和致病过程中的部分功能。主要研究结果如下：1．利用长距离PCR从稻瘟病菌附着胞cDNA文库中克隆了mnh6和mtp1基因的cDNA序列，并从基因组DNA中克隆了mnh6和mtp1基因的全长DNA序列。2．使用多种分析软件，分析和预测了MNH6和MTP1蛋白的结构和功能。MNH6为非组蛋白（DNA结合蛋白），属于HMGB蛋白家属。MTP1为一种Ⅲ型膜整合蛋白，具有8个跨膜区，可能结合在细胞膜上。3．通过构建基因敲除载体和原生质体转化，分别获得了mnh6缺失或mtp1缺失的基因缺失突变子，并从DNA水平和RNA水平进行了验证。4．突变子△mnh6的菌落形态不同于野生型GUYl1，菌落呈灰白色，菌丝稀疏，生长速度变慢，产孢菌丝细胞壁的溶剂疏水性消失，菌丝细胞壁容易被细胞壁降解酶降解，产孢减少，孢子形态变得细长，孢子的附着胞形成率降低，附着胞的膨压降低，附着胞对寄主植物表面的穿透能力减弱，侵入后生长速度减慢，喷雾接种后对大麦和水稻C039的致病性消失。mnh6基因重新引入△mnh6后，突变子的表型恢复。5．MNH6-GFP融合蛋白主要在细胞核内表达，说明MNH6蛋白的作用位点主要在细胞核内。MNH6在稻瘟病菌致病循环过程中的各个发育时期具有重要作用，如菌丝生长，产孢，附着胞形成，穿透，侵入生长等时期，表明MNH6是稻瘟病菌致病性和完成侵染循环所必需的。6．突变子△mtp1的菌落形态类似于野生型Guyl1，但菌丝颜色较黑，产孢减少，孢子萌发延迟，附着胞形成延迟，离体接种发现突变子对大麦和水稻C039的致病性与野生型一致。突变子△mtp1在各种培养基上的生长速度与野生型没有差异，两者附着胞膨压也没有区别。7．mtp1启动子指导的GFP蛋白主要在稻瘟病菌的菌丝和孢子中表达，附着胞中表达量较少。mtp1基因对于稻瘟病菌的生长没有明显的作用，但对于稻瘟病菌的产孢、孢子萌发具有重要的作用。它对于稻瘟病菌的致病性是非必需的。