磁珠分选U251细胞系中的脑肿瘤干细胞及其耐药性的初步研究

论文摘要

1.目的第一部分实验旨在运用磁珠分选技术（magnetic cell sorting,MACS）分选人多形性胶质母细胞瘤U251细胞系中的CD133+和CD133-亚群细胞;比较两个亚群细胞在增殖、分化及体内致瘤性等方面的差异,重点探讨CD133+细胞生物学特性;评价CD133作为脑肿瘤干细胞表面标志物的特异性与磁珠分选系统分选脑肿瘤干细胞的效率及特异性。第二部分实验的主要目的是研究和比较CD133+细胞亚群与CD133-细胞亚群耐药性的差异,并检测两个亚群细胞在ABC转运体、DNA修复及抗凋亡基因等表达的差异,初步分析CD133+细胞亚群的耐药机制。2.方法第一部分实验通过磁珠分选人多形性胶质母细胞瘤U251细胞系中的CD133+和CD133-细胞亚群,通过流式细胞仪检测分选的纯度和两个亚群细胞的细胞周期;利用MTT试验和单克隆形成率实验检测两个亚群细胞的增殖能力;运用免疫荧光检测CD133+细胞亚群的多向分化能力以及CD133+细胞增殖形成的BTS的分化情况;最后通过裸鼠移植实验,检测两个亚群细胞在裸鼠体内致瘤性的差异。第二部分实验在第一部分磁珠分选细胞的基础上,观察CD133+细胞与CD133-细胞在抗肿瘤药物作用下形态学的变化;利用MTT试验和流式细胞仪检测CD133+细胞亚群与CD133-细胞亚群对抗肿瘤药物替尼泊苷、卡莫司汀和顺铂的敏感性;通过RT-PCR方法检测两个亚群细胞在ABC转运子（MDR1、BCRP、MRP）、DNA修复基因（MGMT）及抗凋亡（Bcl-2）基因的表达差异。3.结果第一部分实验结果表明,在U251细胞系中只有大约4.5%的CD133+细胞,经过磁珠分选后,CD133+亚群细胞的细胞纯度可以提高到92.4%;分选后的CD133+细胞接种到含EGF和bFGF的无血清培养基中,具有强大的增殖能力,能增殖形成典型的BTS,而CD133-细胞不具有形成BTS的能力,生长曲线亦显示CD133+细胞增殖能力明显高于CD133-细胞;流式细胞仪实验显示CD133+细胞的细胞增殖率为40.1%,CD133-细胞的细胞增殖率为30.6%;单克隆形成率实验显示CD133+细胞能形成BTS的细胞比率达到78.5%-92.4%,而CD133-细胞仅有0.8-2.4%;分化实验免疫荧光实验显示CD133+细胞能分化为具有GFAP和NeuN成熟表型的肿瘤细胞,且CD133+细胞增殖形成的BTS亦能分化为具有GFAP和NeuN成熟表型的肿瘤细胞;裸鼠致瘤实验显示CD133+的致瘤率为71.42%,而CD133-细胞没有致瘤性。第二部分实验结果表明,CD133-细胞在抗肿瘤药物作用下凋亡形态学改变明显,CD133+细胞仍能维持生长;MTT实验显示,CD133-细胞对抗肿瘤药物替尼泊苷、卡莫司汀和顺铂的敏感性明显高于CD133+细胞;流式细胞仪试验显示在中等浓度的替尼泊苷作用下,CD133-细胞的凋亡明显,并出现明显的“亚G1峰”,而CD133+细胞并未受到明显抑制和杀灭;流式细胞仪检测显示CD133+细胞内的药物蓄积明显低于CD133-细胞;RT-PCR实验显示,MDR1、BCRP、MRP、MGMT和Bcl-2表达在CD133+明显高于CD133-细胞。4.结论U251细胞系中存在少量具有增殖、多向分化与体内致瘤能力的CD133+细胞,CD133+细胞是符合肿瘤干细胞定义的细胞亚群;磁珠分选是理想的脑肿瘤细胞分选系统;CD133+是U251细胞系中的耐药细胞亚群,高表达ABC转运体,DNA修复和抗凋亡基因可能是CD133+细胞耐药的重要机制。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩写词
• 前言
• 第一章 磁珠分选U251细胞系中的脑肿瘤干细胞
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 附图
• 第二章 脑肿瘤干细胞耐药及其机制的初步分析
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 附图
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 攻读学位期间主要研究成果
• 个人简介