猪F-box基因家族部分基因的分子特征、SNP检测与性状关联分析暨FBXO40基因的功能初探

论文摘要

第一部分猪F-box基因家族部分基因的分子特征、SNP检测与性状关联分析从早期追求猪生产性能的提高到现在生产性能与免疫抗性并重,人们已经认识到单纯的提高猪的生产性能会导致抗性降低。一般来说,动物的免疫力决定了动物的健康状况,它与动物的生产性能是密切相关的。这就使得研究者们相继提出了在分子水平揭示疾病发生的原因,并利用现代生物技术从遗传本质上提高动物对病原的抗性,增强动物自身的抵抗力。E3泛素连接酶F-box基因家族参与众多的生物学过程,包括信号转导、细胞周期、细胞凋亡、转录激活和MHCⅠ类抗原提呈等（Bai et al,1996;Craig and Tyers,1999）,与肿瘤的发生和机体免疫密切相关,已逐渐成为一个新研究热点。本研究采用生物信息学、群体遗传学和分子生物学等相结合的方法,对E3泛素连接酶F-box基因家族中3个基因进行了深入的研究,取得了如下结果:1)利用猪EST数据库的信息,分离了猪E3泛素连接酶F-box基因家族中FBXO5和FBXO7基因的完整的编码区（coding sequence,CDS）和部分基因组序列,并进行了蛋白质序列的推导和基因组结构的初步分析,所有的内含子和外显子的拼接位点都符合“GT-AG”规则;分离了猪FBXO40基因的大部分cDNA序列。2)利用IMpRH（The INRA-University of Minnesota porcine radiation hybrid panel）克隆板,对猪FBXO40基因进行了染色体定位,将其定位于SSC13q4.1-4.6,与微卫星S0075和SW1876连锁,连锁的LOD值分别为12.99和7.12。3)采用ClustalW2程序分析了FBXO5、FBXO7两个基因编码氨基酸序列的保守性及FBXO40基因F-box结构域氨基酸序列的保守性,并根据氨基酸序列信息构建了不同物种间的进化树,进行了序列的分子进化分析。4)采用半定量PCR的方法分析了猪FBXO5,FBXO7和FBXO40三个基因在成年五指山猪心脏、骨骼肌、淋巴、脾脏和胸腺等组织中的表达情况。FBXO5、FBXO7和FBXO40基因分别在胸腺、甲状腺和骨骼肌中高表达。5)采用半定量PCR的方法分别检测了猪FBXO5,FBXO7和FBXO40三个基因在正常肾脏组织和癌化的PK15细胞中的表达变化。猪FBXO5基因仅在正常肾脏组织中可检测到表达,猪FBXO40基因仅在PK15细胞中检测到表达,猪FBXO7基因在二者之间基本无差异。6)对上述3个基因进行了SNPs检测,发现如下5个可用PCR-RELP检测的多态位点:FBXO5基因第三内含子第160位碱基的PstⅠ-RFLP(T/C160)和第四内含子第56位碱基的TaqⅠ-RFLP(A/G56);FBXO7基因第三内含子第71位碱基的XbaⅠ-RFLP(T/C71)和第七外显子第113位碱基的NruⅠ-RFLP(T/C113);FBXO40基因第四外显子第299位碱基的HindⅡ（HincⅡ）-RFLP(A/C299)。7)对上述5个SNPs用PCR-RFLP方法在五指山、巴马、莱芜、贵州、通城、大白猪和长白猪中进行群体遗传学分析,结果表明,所有基因座的基因型频率在不同的品种中存在较大差异。8)在我室与温氏集团合作的温氏群体中,对上述SNPs（除XbaⅠ-RFLP位点）与部分免疫相关性状（如:白细胞数、红细胞数和血红蛋白浓度、猪瘟抗体阻断率和血小板分布宽度等）进行了初步关联分析,结果发现,FBXO5基因pstⅠ-RFLP(T/C160)和TaqⅠ-RFLP(A/G56)两个位点FBXO5基因pstⅠ(T/C160)和TaqⅠ(A/G56)两个位点不同基因型的个体都与部分红细胞指标和血小板分布宽度显著相关;FBXO7基因NruⅠ-RFLP(T/C113)多态与32日龄时白细胞数（P＜0.05）和猪瘟抗体阻断率（P＜0.05）在不同基因型的个体间差异显著;FBXO40基因HindⅡ-RFLP(A/C299)不同基因型个体在17日龄时白细胞数（P＜0.01）和淋巴细胞绝对值（P＜0.01）差异极显著。9)在我室与湖北省通城县畜牧局合作组建的通城群体中,对上述SNPs（除NruⅠ-RFLP位点）与部分生产性状（如:初生至上市平均日增重、达90kg（75kg）日龄、屠宰率、肌肉颜色和肌肉pH值等）和部分免疫相关性状（如:白细胞数、红细胞数和血红蛋白浓度等）进行了初步关联分析,结果显示,FBXO40基因HindⅡ（HincⅡ）-RFLP(A/C299)位点,血红蛋白浓度（P＜0.01）、平均血细胞血红蛋白浓度（P＜0.01）、肌肉颜色评分（P＜0.05）和达90kg（75kg）日龄（P＜0.05）在三种基因型个体间存在极显著差异。第二部分FBXO40基因的功能初探肌萎缩是临床上较为常见的一种疾病,去神经支配、禁食、糖尿病和癌症等都可以引起肌肉萎缩。当蛋白质降解速率超过合成速率时,肌肉发生萎缩,已有越来越多的实验发现与泛素-蛋白酶体途径有着紧密的联系。同时,诸多重要的信号通路网络业已被证实彼此交织发挥着不可替代的作用。阐明肌萎缩过程中一些分子代谢调节机制的基本概况就显得尤为重要,这不仅可以加深对肌萎缩类疾病的认识,也可以为治疗该类疾病提供新的依据和促进新的药物靶点的筛选。FBXO40基因是一个与肌肉疾病相关的基因,在去神经肌萎缩中表达上调。探讨研究该基因在肌萎缩中的具体作用具有重要意义。本研究采用生物信息学和分子生物学相结合的手段,初步得到以下结果:1) mFBXO40基因编码一个较大的F-box蛋白,是一个骨骼肌特异性表达的基因,具有一个未知功能的Zinc finger TRAF-type结构域。2)生物信息学预测,mFBXO40蛋白没有发现信号肽和线粒体定位信号,但发现明显的内质网信号锚定序列,推测该蛋白定位在内质网。3)成功构建了该基因的荧光融合蛋白表达载体、超表达载体和功能域缺失超表达载体。4)利用融合蛋白表达技术完成了mFBXO40蛋白的亚细胞定位,脂质体包裹转染C2C12细胞并染色后通过激光共聚焦显微镜观察,发现该蛋白集中分布在靠近核外膜的细胞质区域。

论文目录

• 第一部分 猪F-box基因家族部分基因的分子特征、SNP检测与性状关联分析
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 1 文献综述
• 1.1 猪抗病育种研究进展
• 1.1.1 猪抗病育种研究现状
• 1.1.2 抗病力、免疫相关基因研究进展
• 1.2 泛素-蛋白酶体概况
• 1.2.1 泛素-蛋白酶体的组成
• 1.2.2 泛素-蛋白酶体途径的功能
• 1.3 E3泛素连接酶研究现状
• 1.4 F-box基因家族研究进展
• 1.5 E3泛素连接酶在猪抗病育种研究的前景
• 2 研究目的和意义
• 3 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 DNA和RNA样品
• 3.1.2 载体
• 3.1.3 菌株
• 3.1.4 主要试剂
• 3.1.5 主要试剂的配置
• 3.1.6 主要仪器设备及来源
• 3.1.7 主要分子生物学软件和数据库
• 3.2 方法
• 3.2.1 基因组DNA的提取
• 3.2.2 总RNA提取、检测及DNase-Ⅰ处理
• 3.2.3 基因cDNA序列和基因组序列的分离
• 3.2.4 基因染色体定位
• 3.2.5 基因蛋白序列比对及进化树绘制
• 3.2.6 基因的表达谱分析
• 3.2.7 基因的多态检测（SNP）
• 3.2.8 基因多态与性状的关联分析
• 4 结果与分析
• 4.1 组织总RNA的甲醛变性胶电泳检测结果
• 4.2 猪FBXO5、FBXO7和FBXO40基因Contig的获得
• 4.3 猪FBXO5、FBXO7和FBXO40蛋白质序列比对及进化树绘制
• 4.3.1 猪FBXO5和FBXO7基因编码蛋白的序列推导
• 4.3.2 猪FBXO5、FBXO7和FBXO40蛋白序列比对和进化树绘制
• 4.4 猪FBXO5和FBXO7基因的基因组结构
• 4.5 猪FBXO5、FBXO7和FBXO40基因表达谱分析
• 4.5.1 猪FBXO5、FBXO7和FBXO40基因组织表达谱分析
• 4.5.2 猪FBXO5、FBXO7和FBXO40基因时间表达谱分析
• 4.5.3 猪FBXO5、FBXO7和FBXO40基因组织与细胞表达差异
• 4.6 猪FBXO40基因染色体定位
• 4.7 猪FBXO5、FBXO7和FBXO40基因SNP鉴定与遗传变异分析
• 4.7.1 猪FBXO5、FBXO7和FBXO40基因SNP鉴定
• 4.7.2 猪FBXO5、FBXO7和FBXO40基因多态性在不同猪群中的检测
• 4.7.3 基因多态与性状的关联分析
• 5 讨论
• 5.1 猪基因电子克隆策略
• 5.2 总RNA的提取与质量
• 5.3 猪FBXO5、FBXO7和FBXO40基因表达规律
• 5.3.1 关于组织表达谱
• 5.4 猪FBXO40基因染色体定位
• 5.5 猪FBXO5、FBXO7和FBXO40基因SNP检测
• 5.6 猪FBXO5、FBXO7和FBXO40等位基因频率分析及关联分析
• 5.6.1 猪FBXO5、FBXO7和FBXO40基因等位基因频率分析
• 5.6.2 猪FBXO5、FBXO7和FBXO40基因不同基因型与性状关联分析
• 6 小结
• 6.1 本研究主要结论
• 6.2 本研究的特色与创新之处
• 6.3 本研究的不足之处及由本研究所引出的问题
• 第二部分 FBXO40基因的功能初探
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 1 文献综述
• 1.1 肌萎缩研究概况
• 1.2 去神经肌萎缩研究进展
• 1.2.1 骨骼肌去神经支配后细胞超微结构的改变
• 1.2.2 骨骼肌去神经支配后蛋白质的改变
• 1.2.3 骨骼肌去神经支配后酶的变化
• 1.2.4 骨骼肌去神经支配后运动终板的变化
• 1.2.5 去神经肌萎缩与细胞凋亡的关系
• 1.3 FBXO40基因研究进展
• 2 研究目的和意义
• 3 材料与方法
• 3.1 材料与试剂
• 3.1.1 主要试剂
• 3.1.2 载体
• 3.1.3 细胞系和菌株
• 3.1.4 主要试剂的配制
• 3.1.5 主要仪器设备及来源
• 3.1.6 主要分子生物学软件和数据库
• 3.2 方法
• 3.2.1 mFBXO40基因物理定位、结构与结构域信息
• 3.2.2 mFBXO40基因表达信息
• 3.2.3 mFBXO40基因蛋白质活性位点和亚细胞定位预测
• 3.2.4 mFBXO40基因进化分析
• 3.2.5 细胞总RNA的提取与cDNA的合成
• 3.2.6 mFBXO40基因荧光融合蛋白表达载体的构建
• 3.2.7 mFBXO40基因超表达载体和功能域缺失载体的构建
• 3.2.8 脂质体转染细胞
• 4 结果与分析
• 4.1 mFBXO40基因物理定位、结构与结构域信息整理结果
• 4.2 mFBXO40基因表达信息整理结果
• 4.3 mFBXO40蛋白质活性位点和亚细胞定位预测
• 4.3.1 mFBXO40蛋白质活性位点预测
• 4.3.2 mFBXO40蛋白质亚细胞定位预测
• 4.4 mFBXO40基因进化分析
• 4.5 mFBXO40基因重组质粒载体双酶切结果
• 4.5.1 mFBXO40基因荧光融合蛋白表达载体双酶切结果
• 4.5.2 mFBXO40基因超表达载体和功能域缺失载体双酶切结果
• 4.6 mFBXO40基因荧光融合蛋白表达载体亚细胞定位结果
• 4.7 mFBXO40基因超表达载体和功能域缺失载体转染结果
• 4.7.1 染后RT-PCR检测目的基因
• 5 讨论
• 5.1 关于载体构建
• 5.2 亚细胞定位结果分析
• 5.3 超表达结果分析
• 6 小结
• 6.1 本研究主要结论
• 6.2 本研究的特色与创新之处
• 6.3 本研究的不足之处及由本研究所引出的问题
• 参考文献
• 附表1 本研究中第一部分用到的引物
• 附表2 本研究中第二部分所用到的引物
• 附表3 缩略词表（Abbreviations）
• 附表4 主要性状的中英文对照和缩写
• 附图1 FBXO5氨基酸序列在不同物种间的比对结果
• 附图2 FBXO7基因在不同物种问的氨基酸序列比对结果
• 附图3 FBXO40基因F-box结构域在不同物种间序列比对结果
• 在读期间发表论文题录
• 致谢