HSP70抑制LPS所致细胞因子表达的分子机制研究

论文摘要

本研究从调控炎症介质基因表达的细胞内信号转导通路，探讨热休克反应（heat shock response，HSR）以及HSP70抑制LPS所致细胞因子表达的机制。 经采用RT-PCR、ELISA检测发现，大肠杆菌脂多糖（LPS）可诱导RAW264.7小鼠巨噬细胞产生大量TNF-α，IL-1β和IL-15等细胞因子。当细胞经受热休克反应（42.5℃1h，恢复12h）后再进行LPS刺激，则LPS诱导的细胞因子表达受到抑制。在此基础上采用过表达HSP70的RAW264.7细胞进行实验，发现HSP70同样抑制了LPS诱导的细胞因子表达。 鉴于细胞内信号转导通路在调控炎症介质基因表达中的作用，本实验采用磷酸化抗体检测MAPK信号通路的活化，分析了HSR以及HSP70对LPS所致MAPK信号通路活化的影响。Western blot结果显示，HSR以及HSP70自身均不影响MAPK的活化（磷酸化）。在LPS刺激30min后，HSR组以及HSP70过表达组中的JNK、ERK、p38的活化（磷酸化）程度与非HSR正常细胞组或转空载体细胞组比较均无明显区别。EMSA结果显示，HSR以及HSP70不影响LPS刺激所致的MAPK下游转录因子AP-1的DNA结合活性。据此我们认为，HSR以及HSP70不影响LPS所致的MAPK信号通路活化，其抑制LPS所致细胞因子表达的机制可能涉及其他因素。 由于NF-κB／IκB信号转导通路的活化在LPS所致炎症反应的发生中具有重要作用，我们进一步分析了HSP70过表达对LPS所致NF-κB信号通路活化的影响。通过免疫荧光、免疫细胞化学及Western blot

论文目录

• 第一章、热休克反应以及 HSP70对 LPS所致炎症因子产生的影响
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.3 统计学处理
• 3 结果
• 3.1 热休克反应以及基因转染使热休克蛋白高表达
• 3.2 热休克反应对 LPS刺激所致炎症介质基因转录的影响
• 3.3 HSP70对 LPS刺激所致炎症介质基因转录的影响
• 3.4 热休克反应对 LPS刺激所致炎症因子释放的影响
• 3.5 HSP70对 LPS刺激所致炎症因子释放的影响
• 4 讨论
• 第二章、热休克反应以及 HSP70对 LPS所致 MAPK信号通路活化的影响
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.3 统计学处理
• 3 结果
• 3.1 不同剂量 LPS对 RAW细胞 MAPK活化的影响
• 3.2 LPS刺激不同时间对 RAW细胞MAPK活化的影响
• 3.3 热休克反应对 LPS刺激所致 MAPK活化（磷酸化）的影响
• 3.4 HSP70对 LPS刺激所致 MAPK活化（磷酸化）的影响
• 3.5 热休克反应及 HSP70对 LPS刺激所致 AP-1 DNA结合活性的影响
• 4 讨论
• 第三章、热休克反应以及 HSP70对 LPS所致 NF-KB通路活化的影响
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.3 统计学处理
• 3 结果
• 3.1 免疫荧光分析 HSP70对 LPS所致 NF-KB（P65）核移位的影响
• 3.2 Western blot分析 HSP70对 LPS所致 NF-KB（P65、P50）核移位的影响
• 3.3 HSR和 HSP70对 LPS刺激所致 NF-KB DNA结合活性的影响
• 3.4 HSR和 HSP70对 LPS刺激所致 IKBα降解的影响
• 4 讨论
• 第四章、热休克反应以及 HSP70抑制 LPS所致 NF-KB活化的机制:对 IKK及磷酸酯酶的影响
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.3 统计学处理
• 3 结果
• 3.1 HSR对磷酸酯酶活性的影响
• 3.2 在LPS刺激下HSP70对磷酸酯酶活性的影响
• 3.3 磷酸酯酶在HSR及HSP70抑制LPS所致炎症介质基因转录中的作用
• 3.4 磷酸酯酶在HSR及HSP70抑制LPS所致炎症释放中的作用
• 3.5 磷酸酯酶在HSP70抑制LPS所致NF-κB（p65）核移位中的作用
• 3.6 在LPS刺激下HSP70与IKK的相互作用
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 攻读学位期间主要成果
• 致谢