人E2F3基因的克隆与表达研究

论文摘要

目的:E2F转录因子是细胞周期中G1期进入S期的重要调控因子。同时,E2F因子与肿瘤的发生和细胞凋亡有着紧密的关系。为了研究人E2F3（E2F家族成员）转录因子的结构和功能,了解其与肿瘤发生的联系,从人组织中克隆E2F3基因,构建其原核表达载体和真核表达载体,实现其原核表达和真核表达,从而为进一步的研究奠定基础。 方法:通过Trizol法抽提人肝癌细胞的总RNA,然后逆转录制备cDNA。以cDNA为模板通过巢式PCR和桥联PCR的方法克隆E2F3基因,构建了四种E2F3基因的原核表达载体pET28a-E2F3、pET32a-E2F3、pQE30-E2F3和pGEX-4T-E2F3和一种真核表达载体pEGFP-N1-E2F3。原核表达载体转化BL21工程菌进行诱导,用Western blot检测重组蛋白。真核表达载体转染T24细胞观察克隆的E2F3基因在真核细胞中有无表达活性。 结果:成功克隆出E2F3全长基因,通过更换不同的表达载体实现了对E2F3基因的原核表达并且对表达的重组蛋白用Western方法进行了检测。另外还构建了E2F3基因的真核表达载体,通过转染T24细胞表明构建的E2F3真核表达载体具有表达活性,这为以后的细胞学实验做好了前期的准备。 结论:E2F3基因近5’端一段富含GC的序列会严重影响E2F3基因的PCR扩增,我们推测这段序列可能是E2F3基因的一个内部调控区,它可能会通过形成二级发夹结构来调控E2F3基因的表达。另外发现E2F3基因在不同的原核表达载体中存在表达差异,融合有GST的E2F3基因较易实现原核表达,这可能是因为表达载体功能元件的差异和E2F3基因本身的一些特点所致。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 前言
• 第二部分 材料和方法
• 2.1 主要试剂和材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 人E2F3基因的克隆
• 2.2.2 E2F3原核表达载体的构建、表达诱导和Western检测
• 2.2.3 真核表达载体pEGFP-N1-E2F3的构建
• 第三部分 结果与分析
• 3.1 基因的克隆
• 3.1.1 RT-PCR
• 3.1.2 两轮PCR
• 3.1.3 降落PCR（Touch-down PCR）
• 3.1.4 巢式PCR（nested-PCR）
• 3.1.5 TA克隆测序
• 3.1.6 桥联PCR（overlap-PCR）
• 3.2 E2F3原核表达载体的构建及原核表达
• 3.2.1 原核表达载体pET28a-E2F3和pET32a-E2F3质粒构建
• 3.2.2 原核表达载体pQE30-E2F3的构建
• 3.2.3 原核表达载体pGEX-4T-E2F3的构建
• 3.2.4 原核蛋白表达诱导
• 3.2.5 重组蛋白的Western检测
• 3.3 真核表达载体的构建及其细胞学实验
• 3.3.1 真核细胞表达载体pEGFP-N1-E2F3的构建
• 3.3.2 E2F3在真核细胞中的表达
• 第四部分 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附图