论文题目: 液质联用技术在生命磷化学中的分析应用研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 有机化学
作者: 刘红霞
导师: 赵玉芬
关键词: 生命磷化学,磷酰化修饰,核苷酸,生物医药分析,农药残留
文献来源: 郑州大学
发表年度: 2005
论文摘要: 生命科学被誉为21世纪的最前沿科学之一。随着人类第一张基因序列草图的完成和发展，生命科学的研究正在进入一个崭新的后基因组学，即蛋白质组学时代。正如基因草图的提前绘制得益于大规模全自动毛细管电泳测序技术一样，借助于现代生物质谱技术，后基因组研究将得到迅猛发展。而现代分离技术和生物质谱的联用技术，极大地扩展了生物质谱的应用领域，正在成为生命科学研究中必不可少的技术支撑。 论文用Atherton-Todd反应，以二乙基亚磷酸酯(DEPH)为磷酰化试剂，在水、醇、四氯化碳和三乙胺存在下，将磷酰基引入含碱性氨基酸的肽段，成功实现了对氨基酸、肽和蛋白质的磷酰化修饰。用电喷雾质谱(ESI／MS)对20种氨基酸进行磷酰化反应的过程进行了在线跟踪，发现只有赖氨酸(Lys)和组氨酸(His)可生成二磷酰化产物。并用ESI／MS和液质联用(HPLC／MS)等现代分析技术，对十种已知序列的肽段和三种常用的蛋白质(胰岛素、溶菌酶和细胞色素C)进行了磷酰化反应产物的分离分析，根据肽段和蛋白质的分子量增加值，确定了肽段和蛋白质中所含Lys、His残基的数目，验证了修饰位点发生在肽链的Lys、His残基上和N端，同时，根据对色谱分离的组分进行MS解析，进一步确认了多种形态的磷酰化产物。研究结果将有助于肽的一级序列分析。 研究建立了N-磷酰化丙氨酸与腺苷反应体系中的单腺苷酸和二腺苷单磷酸等产物的HPLC／ESI／MS分离分析方法，并对2′-AMP，3′-AMP，5′-AMP和3′-5′ApA的MS裂解机理进行了研究。结果表明，HPLC／ESI／MS可以快速、简便、准确地鉴别和定量该复杂反应体系中痕量的2′-AMP、3′-AMP、5′-AMP、3′-5′ApA。首次选择了六种不同极性的N-磷酰化氨基酸与四种核苷混合液进行反应，并用所建立的HPLC／ESI／MS分析方法对混合液反应体系进行了分离分析，通过对可能生成的核苷酸产物XMP、XpY进行离子抽提和MS信息分析，结果不仅观察到了单核苷酸(XMP)和二核苷单磷酸(XpY)的产物生成，而且发现不同反应体系所产生的核苷酸种类和含量都不同，结果表明了不同极性的氨基酸与核苷混合液反应时所表现出的活性差异。该研究结果将为“磷酰化氨基酸为生命起源过程中核酸、蛋白质共同起源”学说，提供一定的实验数据和先进的研究方法。 对地塞米松磷酸钠(DexP)的ESI／MS参数进行了优化，探讨了DexP的质谱裂解规律，研究建立了DexP在不受豚鼠外淋巴液背景干扰情况下的HPLC分离分析条件。利用
论文目录:
中文摘要
Abstract
第一章 绪论
1.1 生命磷化学研究
1.1.1 磷与生命起源学说
1.1.2 生命磷化学
1.2 生物质谱和液质联用
1.2.1 生物质谱
1.2.2 ESI／MS技术简介
1.2.3 HPLC／ESI／MS技术简介
1.2.4 HPLC／ESI／MS在磷酰化氨基酸、肽和蛋白质中的分析研究进展
1.2.5 HPLC／MS在碱基、核苷和核苷酸中的分析研究进展
1.2.6 HPLC／ESI／MS在生物医学中的分析研究进展
1.2.7 HPLC／ESI／MS在烟草残留含量研究中的分析研究进展
1.3 博士论文的设计思路和主要研究内容
1.3.1 磷酰化多肽和磷酰化蛋白质的合成及ESI／MS、HPLC／MS分析研究
1.3.2 磷酰化氨基酸和核苷混合物反应体系的ESI／MS和HPLC／MS分析研究
1.3.3 HPLC／ESI／MS在生物医药领域中的分析应用研究
1.3.4 HPLC／ESI／MS在食品安全领域中的分析应用研究
第二章 氨基酸、肽和蛋白质的磷酰化反应及HPLC／ESI／MS分析研究
2.1 实验部分
2.1.1 仪器与试剂
2.1.2 二乙基亚磷酸酯(DEPH)的合成
2.1.3 氨基酸的磷酰化反应
2.1.4 肽的磷酰化反应
2.1.5 蛋白质的磷酰化反应
2.1.5.1 胰岛素的磷酰化反应
2.1.5.2 溶菌酶的磷酰化反应
2.1.5.3 细胞色素C的磷酰化反应
2.2 结果与讨论
2.2.1 二乙基亚磷酸酯(DEPH)的质谱分析
2.2.2 磷酰化氨基酸的分析
2.2.2.1 磷酰化氨基酸的反应机理
2.2.2.2 磷酰化赖氨酸的ESI／MS分析
2.2.2.3 磷酰化组氨酸的ESI／MS分析
2.2.2.4 赖氨酸和组氨酸混合液磷酰化的ESI／MS观察
2.2.2.5 磷酰化赖氨酸和组氨酸的~(31)P-NMR分析
2.2.3 磷酰化肽的ESI／MS分析
2.2.3.1 磷酰化肽结合DEPH数目的ESI／MS分析
2.2.3.2 P01331肽磷酰化反应的ESI／MS分析
2.2.3.3 肽段P01345磷酰化反应的ESI／MS分析
2.2.3.4 肽段P02814磷酰化反应的ESI／MS分析
2.2.4 蛋白质的磷酰化
2.2.4.1 胰岛素的磷酰化
2.2.4.1.1 磷酰化胰岛素的ESI／MS分析
2.2.4.1.2 磷酰化胰岛素的HPLC／ESI／MS分析
2.2.4.2 溶菌酶的磷酰化
2.2.4.2.1 磷酰化溶菌酶的ESI／MS分析
2.2.4.2.2 磷酰化溶菌酶的HPLC／ESI／MS分析
2.2.4.3 磷酰化细胞色素C的ESI／MS分析
2.3 本章小结
第三章 磷酰化氨基酸和核苷混合液反应体系的HPLC／MS分析研究
3.1 实验部分
3.1.1 仪器与试剂
3.1.2 N-磷酰化丙氨酸与腺苷A反应体系的HPLC／ESI／MS研究
3.1.2.1 腺苷单磷酸和二腺苷单磷酸的标准溶液配制及ESI／MS／MS分析
3.1.2.2 腺苷单磷酸和二腺苷单磷酸的混合溶液配制及HPLC／ESI／MS分析
3.1.2.3 N-磷酰化丙氨酸与腺苷A的反应(反应体系Ⅰ)
3.1.3 N-磷酰化氨基酸与核苷混合液的反应及HPLC／ESI／MS分析
3.2 结果与讨论
3.2.1 腺苷酸的ESI／MS／MS分析
3.2.2 二腺苷单磷酸的ESI／MS／MS分析
3.2.2.1 正离子模式下二腺苷单磷酸(3′-5′ApA)的ESI／MS／MS分析
3.2.2.2 负离子模式下二腺苷单磷酸(3′5′ApA)的ESI／MS／MS分析
3.2.3 腺苷酸和二腺苷单磷酸的混合标准溶液的HPLC／ESI／MS分析
3.2.4 N-磷酰化丙氨酸与腺苷A反应体系的HPLC／ESI／MS研究
3.2.5 N-磷酰化氨基酸与核苷混合液反应体系的研究
3.2.5.1 N-磷酰化氨基酸与核苷混合液的反应条件优化
3.2.5.2 N-磷酰化氨基酸与核苷混合液反应体系的ESI／MS分析
3.2.5.3 N-磷酰化氨基酸与核苷混合液反应体系的HPLC／ESI／MS分析
3.3 本章小结
第四章 HPLC／ESI／MS用于地塞米松磷酸钠在内耳外淋巴液中的药代力学研究
4.1 实验部分
4.1.1 仪器
4.1.2 试剂与溶液
4.1.2.1 试剂
4.1.2.2 地塞米松磷酸钠溶液配制及其ESI／MS／MS分析
4.1.2.3 地塞米松磷酸钠溶液的标准工作曲线
4.1.3 实验动物、给药和样品制备
4.1.3.1 动物分类
4.1.3.2 给药和取样
4.1.4 回收率实验
4.1.4.1 空白外淋巴液的制备
4.1.4.2 DexP回收率测定
4.1.5 样品测定和药时曲线
4.1.5.1 腹腔注射DexP在内耳外淋巴液的药物测定及药时曲线
4.1.5.2 鼓室注射DexP在内耳外淋巴液的药物测定及药时曲线
4.1.6 HPLC／MS分析条件
4.2 结果与讨论
4.2.1 DexP的ESI／MS分析
4.2.2 DexP的HPLC／MS分析
4.2.3 HPLC／UV方法的线性方程和最低检测限
4.2.4 HPLC／UV方法的回收率
4.2.5 HPLC／UV方法DexP峰面积的重现性
4.2.6 药物动力学研究
4.2.6.1 腹腔注射DexP在内耳外淋巴液的药物测定及药时曲线
4.2.6.2 鼓室注射DexP在内耳外淋巴液的药物测定及药时曲线
4.3 本章小结
第五章 HPLC／ESI／MS用于肝硬化自发性腹水患者肠黏膜通透性的研究
5.1 实验部分
5.1.1 仪器
5.1.2 试剂与溶液
5.1.2.1 试剂
5.1.2.2 乳果糖、甘露醇储备溶液的配制及其ESI／MS／MS分析
5.1.2.3 乳果糖、甘露醇溶液的标准工作曲线
5.1.3 研究对象、给药和样品制备
5.1.3.1 研究对象
5.1.3.2 给药、尿样采集
5.1.3.4 尿样处理
5.1.4 回收率实验
5.1.4.1 空白尿液的制备
5.1.4.2 L和M的回收率测定方法
5.1.5 L／M数据统计分析
5.1.6 HPLC／MS分析条件
5.2 结果与讨论
5.2.1 L和M的ESI／MS
5.2.2 L和M的色谱条件的选择
5.2.3 HPLC／RID方法的标准曲线和最低检测限
5.2.4 方法的回收率
5.2.5 峰面积的重现性
5.2.6 L、M的HPLC／MS分析方法
5.2.7 尿样的HPLC／MS分析
5.2.8 L／M与血浆内毒素(ET)的关系
5.3 本章小结
第六章 烟草中七种除草剂残留的HPLC／ESI／MS分析研究
6.1 实验部分
6.1.1 仪器与试剂
6.1.2 标准储备液和标准溶液
6.1.3 优化的HPLC和HPLC／MS分析条件
6.1.4 样品提取方法优化
6.1.4.1 ASE提取
6.1.4.2 乙酸乙酯超声波提取
6.1.5 样品纯化方法优化
6.1.5.1 第一、二组的GPC纯化方法
6.1.5.2 吡虫啉的液液分配纯化方法
6.1.6 重复性和回收率实验
6.1.6.1 重复性
6.1.6.2 回收率(全程)
6.2 结果与讨论
6.2.1 UV吸收光谱和检测波长确定
6.2.2 样品提取方法优化结果
6.2.3 纯化方法优化结果
6.2.4 第一组二甲戊灵、异丙乐灵、仲丁灵三种除草剂LC／MS及残留
6.2.4.1 二甲戊灵、异丙乐灵、仲丁灵三种除草剂色谱条件的选择
6.2.4.2 标准曲线、最低检测限、回收率
6.2.4.3 二甲戊灵、异丙乐灵、仲丁灵的ESI／MS与HPLC／ESI／MS
6.2.4.4 烟草样品中二甲戊灵、异丙乐灵、仲丁灵测定
6.2.5 第二组草乃敌、敌草胺、异丙甲草胺三种除草剂LC／MS及残留
6.2.5.1 第二组草乃敌、敌草胺、异丙甲草胺三种除草剂色谱条件的选择
6.2.5.2 标准曲线、最低检测限和回收率的测定
6.2.5.3 除草剂草乃敌、敌草胺、异丙甲草胺的ESI／MS与HPLC／MS
6.2.5.4 烟草中草乃敌、敌草胺、异丙甲草胺测定
6.2.6 第三组吡虫啉的LC／MS及残留
6.2.6.1 吡虫啉的色谱条件选择
6.2.6.2 吡虫啉的标准曲线、最低检测限、回收率
6.2.6.3 吡虫啉残留测定
6.4 本章小结
结论
附录
参考文献
攻读博士学位期间国内外学术刊物上发表或接收的论文
致谢
发布时间: 2006-10-10
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