α-苦瓜素在毕赤酵母中表达及生物活性分析

论文摘要

α-苦瓜素（alpha-momorcharin,a-MMC）是苦瓜种仁的一种单链糖蛋白,具有堕胎、抗肿瘤、抗菌及抗病毒等多种生物功能。α-MMC含有23个氨基酸的信号肽和263个氨基酸的成熟肽,糖基化位点位于Asn-227,侧链位于Trp-70负责活性中心Glu-160的开关。α-MMC属于Ⅰ型核糖体失活蛋白,具有N-糖苷酶、RNase及DNase活性,α-MMC的多种生物功能可能都与其核糖体失活的性质有关。本研究利用基因工程技术生产重组α-MMC,这将为其作用机理的进一步研究奠定基础。 本研究采用RT-PCR技术从新鲜苦瓜叶片中获取成熟肽基因编码区cDNA（命名为α-MMCC）;将扩增得到的基因片段插入克隆载体pGEM-T Easy Vector中,酶切鉴定正确后进行序列测定,结果证明得到的α-MMCC与预计的核苷酸序列完全一致;构建了携带有α-MMCC的毕赤氏酵母分泌型表达质粒pPICZαB/α-MMCC,重组质粒经Sac Ⅰ线性化后转化宿主菌GS115,通过基因组PCR鉴定重组子及其表型。在此基础上通过正交实验优化甲醇诱导条件,经SDS-PAGE及Western blot分析鉴定,筛选高效表达菌株。重组酵母在pH值为6.0的BMGY中增殖培养,甲醇终浓度为1.0%的BMMY（pH 6.5）中诱导72h,重组蛋白可达总蛋白量的15%左右。 发酵上清液利用镍琼脂糖凝胶FF亲和层析分离纯化,纯度达90%以上。活性分析表明,重组α-MMC对Hela有明显的生长抑制效应,且呈剂量和时间依赖性。重组α-MMC抑制肿瘤生长的作用机理还有待进一步研究。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要（abstract）
• 1 引言
• 1.1 α-苦瓜素的研究进展
• 1.1.1 α-MMC的酶学活性
• 1.1.2 α-MMC的分子结构
• 1.1.3 α-MMC进入细胞过程
• 1.1.4 α-MMC的生物学功能
• 1.2 甲醇毕赤氏酵母P．pastoris表达系统研究进展
• 1.2.1 P．pastoris的遗传学特性
• 1.2.2 P．pastoris的生物学特性
• 1.2.3 P．pastoris的甲醇代谢途径
• 1.2.4 P．pastoris表达系统的构成
• 1.2.5 影响产物表达的因
• 1.2.6 重组蛋白的翻译后修饰——糖基化
• 1.2.7 缺陷及对策
• 1.3 本研究的目的意义、内容和技术路线
• 2 材料
• 2.1 菌株和质粒
• 2.2 酶、试剂盒及生化试剂
• 2.3 主要仪器设备
• 3 方法
• 3.1 引物设计与α-MMC基因扩增
• 3.2 α-MMC基因的克隆与测序
• 3.3 α-MMC基因酵母重组表达载体的构建及鉴定
• 3.4 工程菌GS115/pPICα-B/α-MMCC的构建与筛选
• 3.5 α-MMC基因的诱导表达
• 3.6 重组蛋白价MMC的SDS-PAGE电泳分析
• 3.7 重组蛋白α-MMC的Western blot分析
• 3.8 重组酵母甲醇诱导条件的优化
• 3.9 重组蛋白α-MMC的分离与纯化
• 3.10 α-MMC生物活性检
• 4 结果与分析
• 4.1 α-MMC cDNA的克隆
• 4.1.1 苦瓜总RNA提取
• 4.1.2 利用 RT-PCR技术获取α-MMC cDNA
• 4.1.3 α-MMCcDNA基因的克隆及鉴定
• 4.2 pPICZα-B/α-MMCC酵母表达载体的构建及双酶切鉴定
• 4.3 工程菌GS115/pPICZα-B/α-MMCC的构建及筛选
• 4.3.1 酵母转化
• 4.3.2 重组酵母阳性克隆的筛选与鉴定
• 4.4 甲醇诱导条件的优化
• 4.4.1 BMGY最适pH值的确定
• 4.4.2 甲醇最佳诱导时间的确定
• 4.4.3 诱导培养基 BMMY最佳pH值的确定
• 4.4.4 甲醇诱导终浓度的确定
• 4.5 重组蛋白Western blot鉴定
• 4.6 重组蛋白含量测定
• 4.7 重组蛋白的纯化
• 4.8 重组蛋白生物学活性测定
• 附:结果图片
• 5 讨论
• 5.1 苦瓜籽 RIP的开发与应用前景
• 5.2 选择合适的体系（系统）对α-MMC表达及应用的影响
• 5.3 毕赤酵母表达系统的应用特点
• 5.3.1 目的蛋白结构分析
• 5.3.2 表达载体的选择
• 5.3.3 密码子偏爱性改造
• 5.3.4 最适拷贝数的确定
• 6 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢