β-甘露聚糖酶基因整合诱导型表达载体的构建及在野生酵母菌中的表达

论文摘要

从猪肠道内分离到定植野生型酵母菌4株,分别命名为JSY1、JSY2、JSY3、JSY4。进行G418敏感性研究,发现JSY4作为载体共转化菌株最方便筛选。克隆猪肠道野生型酵母菌JSY4的25SrDNA片段,与YIP5经EcoRⅠ与BamHⅠ双酶切连接,构建出载体YIP5-rDNA。BamHⅠ与SalⅠ双酶切YIP5-rDNA,EcoRⅠ与SalⅠ双酶切pGEM-ManⅠ得到ManⅠ基因,BglⅡ与EcoRⅠ双酶切pPIC9K得到AOX1启动子,将三个片段连接,构建出高拷贝整合诱导型表达载体YIP5-rDNA-AOX1-ManⅠ。提取构建出的表达载体DNA用SalⅠ单酶切线性化与pAX15按3:1的比例共转化JSY4,在含300μg/ml G418的YEPD平板上筛选工程菌转化子,并且PCR方法鉴定出共转华的阳性转化子。用2%甲醇诱导共转化工程菌,成功表达出β-甘露聚糖酶,其比活力为0.90 IU/ml,而且传代10次后仍能检测到ManⅠ基因表达产物β-甘露聚糖酶,实现了β-甘露聚糖酶基因随共转化工程菌染色体稳定遗传及表达的目的。对温度、pH、溶氧条件进行优化,确定β-甘露聚糖酶表达最佳发酵条件。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 研究背景
• 1.1.1 β-甘露聚糖酶研究历史和菌种选育
• 1.1.2 β-甘露聚糖酶作用方式及结构分析
• 1.1.3 β-甘露聚糖酶的分子生物学
• 1.2 毕氏酵母表达外源基因的概述
• 1.2.1 载体
• 1.2.2 启动子
• 1.2.3 信号肽序列
• 1.2.4 选择标记
• 1.2.5 菌株
• 1.2.6 发酵及其影响因素
• 1.2.7 糖基化
• 1.2.8 缺陷及对策
• 1.2.9 应用及前景
• 1.3 实验目的与实验内容
• 2 材料
• 2.1 菌株及载体
• 2.2 试剂及培养基配制
• 2.3 酶
• 2.4 PCR引物
• 2.5 仪器
• 3 方法
• 3.1 野生酵母染色体DNA 提取
• 3.1.1 菌株培养
• 3.1.2 野生酵母染色体 DNA 提取
• 3.1.3 比色法确定DNA浓度与纯度
• 3.2 酵母25SrDNA 片段PCR 及分析
• 3.2.1 25SrDNA 片段 PCR 扩增
• 3.2.2 琼脂糖凝胶电泳鉴定
• 3.2.3 25SrDNA 片段序列分析
• 3.3 高拷贝整合载体YIP5-rDNA 构建
• 3.3.1 质粒DNA提取
• 3.3.2 用无DNA酶的RNA酶处理质粒DNA
• 3.3.3 酵母25SrDNA PCR产物限制性内切酶消化
• 3.3.4 质粒YIP5限制性内切酶消化
• 3.3.5 酶切产物纯化
• 3.3.6 酶切产物胶回收
• 3.3.7 载体和25SrDNA PCR片段连接
• 3.3.8 感受态细胞制备
• 3.3.9 连接产物转化感受态细胞
• 3.3.10 YIP5-rDNA 阳性克隆子筛选与鉴定
• 3.4 高拷贝整合诱导型表达载体 YIP5-rDNA-AOX1-ManⅠ构建
• 3.4.1 质粒pGEM-ManΙ限制性内切酶消化
• 3.4.2 质粒pPIC9K 限制性内切酶消化
• 3.4.3 质粒YIP5-rDNA 限制性内切酶消化
• 3.4.4 半纤维素酶基因（ManⅠ）、强启动子（AOX1）与载体（YIP5-rDNA）连接
• 3.4.5 YIP5-rDNA-AOX1-ManⅠ载体转化与筛选
• 3.5 野生酵母菌对G418敏感性实验
• 3.6 载体YIP5-rDNA-AOX1-ManⅠ与pAX15 共转化野生酵母菌
• 3.6.1 载体YIP5-rDNA-AOX1-ManⅠ用SalⅠ线性化
• 3.6.2 野生酵母细胞的准备
• 3.6.3 共转化
• 3.6.4 共转化阳性克隆子筛选与鉴定
• 3.7 β-甘露聚糖酶基因的表达
• 3.7.1 β-甘露聚糖酶提取及纯化
• 3.7.2 二硝基水杨酸法测定β-甘露聚糖酶活力
• 3.8 影响β-甘露聚糖酶基因表达的因素
• 3.8.1 不同温度对β-甘露聚糖酶基因表达影响
• 3.8.2 不同pH 对β-甘露聚糖酶基因表达影响
• 3.8.3 不同溶氧对β-甘露聚糖酶基因表达影响
• 3.9 ELISA双抗夹心法检测转β-甘露聚糖酶基因表达产物
• 3.9.1 鼠抗β-甘露聚糖酶多克隆抗体（AB1）效价测定
• 3.9.2 兔抗?-甘露聚糖酶多克隆抗体（AB2）效价测定
• 3.9.3 ELISA双抗夹心法检测转β-甘露聚糖酶基因野生酵母菌表达产物
• 4 结果
• 4.1 酵母基因组DNA 提取结果
• 4.2 25SrDNA 片段PCR 结果
• 4.2.1 25SrDNA 片段PCR 结果
• 4.2.2 25SrDNA 片段PCR 产物序列分析结果
• 4.3 野生酵母菌G418 敏感性实验结果
• 4.4 YIP5-rDNA 载体鉴定结果
• 4.4.1 YIP5-rDNA 载体大小鉴定结果
• 4.4.2 YIP5-rDNA 载体的PCR 鉴定结果
• 4.5 YIP5-rDNA-AOX1-ManⅠ载体鉴定结果
• 4.5.1 YIP5-rDNA-AOX1-ManⅠ载体大小鉴定结果
• 4.5.2 YIP5-rDNA-AOX1-ManⅠ载体酶切鉴定结果
• 4.5.3 YIP5-rDNA-AOX1-ManⅠ载体的ManⅠ基因PCR 鉴定结果
• 4.5.4 YIP5-rDNA-AOX1-ManⅠ载体的rDNA 片段 PCR 鉴定结果
• 4.6 YIP5-rDNA-AOX1-ManⅠ和pAX15 载体的共转化野生酵母菌鉴定结果
• 4.7 β-甘露聚糖酶基因在野生酵母菌中的表达与G418 抗性缺失
• 4.8 影响共转化野生酵母菌目的基因表达的因素
• 4.8.1 不同温度对β-甘露聚糖酶基因表达的影响
• 4.8.2 不同 pH 对 β-甘露聚糖酶基因表达的影响
• 4.8.3 不同溶氧条件对 β-甘露聚糖酶基因表达的影响
• 4.9 β-甘露聚糖酶纯化结果
• 4.10 ELASA检测结果
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介