鸡RNAi逆转录病毒载体的构建及在BAF57基因功能研究中的初步应用

论文摘要

哺乳动物SWI/SNF染色质重塑复合体,包含约10个蛋白质元件,包括Brg1、BAF155、BAF170、BAF60和BAF57,它们在转录调控中起重要作用。有研究发现BAF57与ER-α（雌激素受体）和AR（雄激素受体）之间存在着相互作用,并能辅助补充SWI/SNF染色质重塑复合体激活激素依赖的启动子转录活性。我们之前也发现BAF57在雌雄胚胎发育初期呈差异表达。本研究利用禽类逆转录病毒载体RCASBP结合U6启动子构建RNAi载体,同时对鸡BAF57基因进行RNAi,对其在性别分化和性腺发育过程中的作用及其调控网络进行探究。结果如下：1.使用一步PCR法从9-11日龄白来航鸡的基因组DNA中扩增鸡U6启动子（cU6-4）及shRNA,从质粒pBI-EGFP中扩增GFP,随后与逆转录病毒RCASBP连接,构建完整RNAi病毒载体。经过病毒DNA转染、病毒包装、收集及提取等步骤,最终获得感染用病毒。结果表明,病毒载体构建成功。2.利用包装获得的病毒,分别在细胞和鸡胚中进行感染,观察感染情况。结果显示,细胞感染效果良好,荧光表达强烈。在病毒转染后48-72h后,开始出现荧光表达,培养5-7天后可用于收集细胞,提取RNA,做半定量检测。鸡胚感染前,利用胶带剪切法开窗、处理鸡胚。之后注射病毒,培养5-7天后进行观察,可看到鸡胚有强烈的荧光表达,但感染鸡胚全部死亡。3.收集感染后的细胞,提取RNA、反转录,半定量检测目的基因BAF57及相关性别分化基因——Sox9、Dmrt1、AMH和芳香化酶的表达量。结果表明,目的基因BAF57的表达水平下降,ER-α（雌激素受体）和AR（雄激素受体）的表达量也随之下降,Sox9的表达水平也出现下调,但没有检测到Dmrt1、AMH及芳香化酶基因的表达（DF-1细胞中没有表达）。本研究成功利用了逆转录病毒载体进行RNAi,完成了对鸡性腺发育候选基因BAF57的初步研究,为进一步研究BAF57基因奠定了基础。同时,为实验室引进了逆转录病毒载体,完善了实验室RNAi技术的平台。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 1 文献综述
• 1.1 引言
• 1.2 鸡性别分化研究进展
• 1.2.1 性别决定机制
• 1.2.2 性腺分化
• 1.2.3 性别分化候选基因
• 1.3 RNAI
• 1.3.1 RNAi的发现
• 1.3.2 RNAi的分子机理
• 1.3.3 RNAi的实验策略
• 1.3.4 RNAi的效果检测
• 1.3.5 RNAi在鸡胚中的应用
• 1.4 研究目的和意义
• 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 样品
• 2.1.2 所用试剂和试剂盒
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 shRNA的设计
• 2.2.2 病毒载体的构建
• 2.2.3 病毒包装和提取
• 2.2.4 感染细胞
• 2.2.5 感染鸡胚
• 2.2.6 结果检测
• 结果与分析
• 3.1 病毒载体构建结果
• 3.1.1 GFP扩增
• 3.1.2 U6+shRNA扩增
• 3.1.3 RCASBP与GFP+U6+shRNA连接及测序
• 3.2 病毒包装结果
• 3.2.1 病毒转染
• 3.2.2 病毒滴度测定
• 3.3 细胞感染结果
• 3.3.1 感染DF-1细胞
• 3.3.2 目的及相关基因表达量检测
• 3.4 鸡胚感染结果
• 讨论
• 4.1 病毒载体构建
• 4.1.1 U6及shRNA的选择
• 4.1.2 U6及shRNA连接的策略
• 4.2 病毒感染
• 4.2.1 感染效率
• 4.2.2 感染方法
• 4.3 目的基因BAF57
• 4.3.1 BAF57的调控
• 4.3.2 BAF57的作用
• 结论
• 5.1 本研究所取得的结果
• 5.2 本研究的创新点和特色
• 5.3 本研究的不足和下一步需要研究的问题
• 参考文献
• 致谢