利用转基因技术创建紫花苜蓿耐盐新种质的研究

论文摘要

作物生长、产量和质量受土壤盐渍化限制,已成为世界上的一个普遍问题。紫花苜蓿（Medicago Sativa L.）是一种优良的豆科牧草,蛋白质含量高,维生素和矿物质含量丰富,氨基酸种类齐全,且适口性好,在我国北方地区的农牧业生产和生态建设中发挥极其重要的作用。然而,多数紫花苜蓿品种耐盐能力差,不合适在盐碱地种植。因此,培育合适在盐碱地种植的耐盐丰产的紫花苜蓿新品种,充分利用盐碱地,提高牧草产量,是发展农牧业经济和改善生态环境的有效途径。现代生物技术育种的迅速发展,为培育新的品种提供了高效快捷的方法。本研究选择紫花苜蓿阿尔冈金品种为材料,通过转基因技术对其进行了耐盐性遗传改良,获得了耐盐性提高的新种质。主要研究结果如下：1、对紫花苜蓿阿尔冈金品种种子发芽期和苗期的耐盐性分析,结果表明225mmol/L和300 mmol/L的NaCl浓度分别是发芽期和苗期耐盐性筛选的适合浓度。2、利用花粉管通道法将盐生植物红树（Rhizophora apiculata L.）总DNA导入紫花苜蓿,获得12株耐盐性强的植株。以供体和受体为对照,对12株耐盐植株进行RAPD分析,条带的差异性表现为新增条带、供体特异条带和受体条带丢失。分析引物S178和引物S198在植株Ms-ra3中出现的供体特异条带和新增条带序列,初步证实外源DNA已经整合到受体的基因组中,而且T0代植株耐盐能力提高可能与外源基因的导入有关。移栽T0代耐盐植株至实验地,人工辅助同株自交授粉,获得T,代种子。225 mmol/L NaCl筛选获得T1代幼苗,T1代幼苗经300 mmol/L NaCl胁迫后测定耐盐相关生理生化指标,结果表明T1代植株耐盐性明显增强。T2代幼苗经0.6%NaCl胁迫处理21 d,获得了T2代耐盐株系。3、比较分析了培养基成分（MS培养基、UM培养基、SH培养基）和激素配比对阿尔冈金品种下胚轴、子叶和子叶节再生的影响,发现子叶节在添加3.0mg/L 6-BA的SH培养基上适宜遗传转化,生根培养时添加0.5mg/L IBA.在此基础上,本研究通过农杆菌介导法首次将盐生植物盐角草（Salicornia europaea L.）Na+/H+逆向运输蛋白基因SeNHXl导入阿尔冈金,PCR检测获得36株T0代转基因植株,移栽温室培养获得6株生长旺盛的植株。RT-PCR检测显示SeNHXl基因在5个转基因植株中获得了表达。0.6% NaCl胁迫表达外源基因的5个转基因植株扦插苗后测定耐盐相关生理生化指标,结果表明这5个转基因植株的多数耐盐相关生理生化指标均优于对照,而且有1个转基因植株（MseNHX75）所测定耐盐相关生理生化指标均优于其他转基因植株。加代培养获得T1代植株,经PCR鉴定筛选获得了T1代转基因株系。4、首次克隆了紫花苜蓿阿尔冈金盐诱导表达基因MsPRP2启动子序列,大小为1521 bp,与GenBank中报道的序列（AF028841）的同源性为93.7%,且含有2个大的AT富含区和1个G-box。成功构建了盐诱导型启动子驱动SeNHX1基因的植物双元表达载体pPZP221（MsPNN）,并利用农杆菌介导法转化紫花苜蓿阿尔冈金,获得转化再生植株。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 引言
• 1.2 盐生植物及植物耐盐性研究进展
• 1.2.1 盐生植物
• 1.2.2 盐胁迫对植物的毒害
• 1.2.3 植物耐盐机理
• 1.2.3.1 渗透调节机理
• 1.2.3.2 离子区隔化
• 1.2.4 植物耐盐相关基因
• 1.2.4.1 渗透调节基因
• 1.2.4.2 离子区隔化相关基因
• 1.2.4.3 耐盐相关转录因子
• 1.2.4.4 抗氧化相关酶基因
• 1.3 导入总DNA耐盐育种研究进展
• 1.3.1 花粉管通道法技术的提出与建立
• 1.3.2 花粉管通道法的可行性与分子证据
• 1.3.3 导入总DNA耐盐育种
• 1.4 紫花苜蓿耐盐育种研究进展
• 1.4.1 紫花苜蓿耐盐杂交育种
• 1.4.2 紫花苜蓿耐盐基因工程研究
• 1.5 本研究的目的和意义
• 第二章 用花粉管通道法导入红树总DNA创建紫花苜蓿耐盐新种质
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 红树基因组DNA的提取
• 2.1.3 外源DNA的导入
• 2.1.4 紫花苜蓿阿尔冈金品种种子发芽期耐盐性分析
• 2.1.5 紫花苜蓿阿尔冈金品种苗期耐盐性分析
• 0代植株的盐胁迫筛选'>2.1.6 T₀代植株的盐胁迫筛选
• 0代植株DNA的提取'>2.1.7 耐盐性T₀代植株DNA的提取
• 2.1.8 RAPD分析
• 2.1.9 RAPD条带的序列分析
• 1代种子获得'>2.1.10 T₁代种子获得
• 1代耐盐性植株获得'>2.1.11 T₁代耐盐性植株获得
• 1代耐盐性植株相关生化指标分析'>2.1.12 T₁代耐盐性植株相关生化指标分析
• 2.1.12.1 叶绿素含量测定
• 2.1.12.2 丙二醛含量测定
• 2.1.12.3 脯氨酸含量测定
• 2.1.12.4 超氧化物歧化酶测定
• 2.1.12.5 过氧化物酶活性测定
• 2.1.12.6 过氧化氢酶活性测定
• 2代种子盆栽耐盐筛选'>2.1.13 T₂代种子盆栽耐盐筛选
• 2.1.13.1 紫花苜蓿盆栽耐盐性分析
• 2代植株耐盐性筛选'>2.1.13.2 T₂代植株耐盐性筛选
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 红树基因组DNA的提取
• 2.2.2 外源DNA的导入
• 0代种子获得'>2.2.3 T₀代种子获得
• 2.2.4 紫花苜蓿阿尔冈金品种种子发芽期耐盐性分析
• 2.2.5 紫花苜蓿阿尔冈金品种苗期耐盐性分析
• 0代植株耐盐性筛选'>2.2.6 T₀代植株耐盐性筛选
• 0代植株DNA的提取'>2.2.7 耐盐性T₀代植株DNA的提取
• 2.2.8 RAPD分析
• 2.2.9 RAPD条带的序列分析
• 1代种子获得'>2.2.10 T₁代种子获得
• 1代耐盐性植株获得'>2.2.11 T₁代耐盐性植株获得
• 1代耐盐性植株耐盐相关生化指标分析'>2.2.12 T₁代耐盐性植株耐盐相关生化指标分析
• 2.2.12.1 叶绿素含量分析
• 2.2.12.2 丙二醛含量分析
• 2.2.12.3 脯氨酸含量分析
• 2.2.12.4 SOD活性分析
• 2.2.12.5 POD、CAT活性分析
• 2代种子盆栽耐盐筛选'>2.2.13 T₂代种子盆栽耐盐筛选
• 2.3 讨论
• +/H⁺逆向转运蛋白基因创建耐盐紫花苜蓿新种质资源'>第三章 转化Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因创建耐盐紫花苜蓿新种质资源
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 SeNHX1基因的PCR扩增
• 3.1.3 表达载体的构建
• 3.1.4 pPZP221（35SNN）质粒转化农杆菌AGL1
• 3.1.4.1 农杆菌AGL1感受态细胞的制备
• 3.1.4.2 pPZP221（35SNN）质粒冻融法转化农杆菌AGL1
• 3.1.4.3 转化农杆菌AGL1的PCR鉴定
• 3.1.4.4 转化农杆菌AGL1的酶切鉴定
• 3.1.5 农杆菌介导pPZP221（35SNN）转化紫花苜蓿阿尔冈金
• 3.1.5.1 外植体侵染
• 3.1.5.2 不定芽的获得及生根培养
• 3.1.6 转化植株的鉴定
• 3.1.6.1 PCR鉴定
• 3.1.6.2 RT-PCR鉴定
• 0代转基因植株的移栽及扦插扩繁'>3.1.7 T₀代转基因植株的移栽及扦插扩繁
• 0代转基因植株的耐盐相关生理生化指标分析'>3.1.8 T₀代转基因植株的耐盐相关生理生化指标分析
• 3.1.8.1 叶绿素含量测定
• 3.1.8.2 丙二醛含量测定
• 3.1.8.3 脯氨酸含量测定
• 3.1.8.4 超氧化物歧化酶测定
• 3.1.8.5 过氧化物酶活性测定
• 3.1.8.6 过氧化氢酶活性测定
• 1代转基因种子的获得'>3.1.9 T₁代转基因种子的获得
• 1代转基因株系的获得'>3.1.10 T₁代转基因株系的获得
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 SeNHX1基因的扩增
• 3.2.2 快速提取质粒法筛选重组子pPZP221（35SNN）
• 3.2.3 PCR鉴定重组子pPZP221（35SNN）
• 3.2.4 重组质粒载体pPZP221（35SNN）酶切鉴定
• 3.2.5 重组表达载体pPZP221（35SNN）测序鉴定
• 3.2.6 转化农杆菌AGL1鉴定
• 3.2.7 农杆菌介导pPZP221（35SNN）外植体
• 3.2.8 不定芽的获得及生根培养
• 3.2.9 转化植株的鉴定
• 3.2.9.1 转化植株的PCR鉴定
• 3.2.9.2 RT-PCR鉴定
• 0代转基因植株的移栽及扦插'>3.2.10 T₀代转基因植株的移栽及扦插
• 0代转基因植株的耐盐相关生理生化指标分析'>3.2.11 T₀代转基因植株的耐盐相关生理生化指标分析
• 3.2.11.1 叶绿素含量分析
• 3.2.11.2 丙二醛含量分析
• 3.2.11.3 脯氨酸含量分析
• 3.2.11.4 SOD活性分析
• 3.2.11.5 POD活性分析
• 3.2.11.6 CAT活性分析
• 1代转基因种子的获得'>3.2.12 T₁代转基因种子的获得
• 1代转基因株系的获得'>3.2.13 T₁代转基因株系的获得
• 3.3 讨论
• 第四章 盐诱导表达基因MsPRP2启动子的克隆及其驱动SeNHX1基因转化紫花苜蓿的研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 引物设计
• 4.1.3 MsPRP2启动子PCR扩增
• 4.1.4 连接反应
• 4.1.5 重组子转化
• 4.1.6 快速提取质粒法筛选重组子
• 4.1.7 重组子PCR鉴定
• 4.1.8 重组子酶切鉴定及测序分析
• 4.1.9 表达载体构建
• 4.1.10 pPZP221（MsPNN）质粒冻融法转化农杆菌AGL1
• 4.1.11 农杆菌AGL1介导pPZP221（MsPNN）转化紫花苜蓿
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 MsPRP2启动子PCR扩增
• 4.2.2 快速提取质粒法筛选重组子
• 4.2.3 重组子PCR鉴定
• 4.2.4 重组子酶切鉴定
• 4.2.5 重组子测序分析
• 4.2.6 表达载体构建
• 4.2.7 转化pPZP221（MsPNN）再生植株的获得
• 4.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 发表及已录用的论文