黑曲霉β-葡萄糖苷酶的基因克隆与表达研究

论文摘要

β-葡萄糖苷酶（BGL）是一类能够水解β-1,4-D-糖苷键的内切水解酶,属于纤维素酶类,它能够降解纤维二糖生成葡萄糖。β-葡萄糖苷酶广泛存在于各种动植物和微生物体内,具有重要研究价值,近年来通过对多种来源的β-葡萄糖苷酶的研究和开发,这类酶已在医药、食品、饲料、造纸、印染、纺织、石油开采及生物技术研究等多方面得到了广泛的应用。因此本研究的主要目的是从黑曲霉中获得β-葡萄糖苷酶基因,并构建工程酵母来高效表达β-葡萄糖苷酶,以解决目前β-葡萄糖苷酶产量低、成本高等问题,同时也为纤维素高效降解,生产燃料乙醇提供有效的解决途径。本研究以黑曲霉Aspergillus niger 3.796为材料,依据其他黑曲霉β-葡萄糖苷酶bgl基因序列设计特异性引物,采用RT-PCR方法克隆到β-葡萄糖苷酶基因cDNA全序列。序列分析表明,该cDNA序列全长2583bp,共编码860个氨基酸,该基因已注册GenBank,并利用生物信息学数据库和软件对该基因及其编码蛋白进行了分析和预测。分析结果表明该β-葡萄糖苷酶属于水解酶家族3成员,其氨基酸序列与其它曲霉相比同源性最高可达96%。本研究利用毕赤酵母Pichia Pastoris GS115分泌表达β-葡萄糖苷酶。将β-葡萄糖苷酶基因克隆到分泌表达载体pPICZaA中,构建重组质粒pPICZaA-bgl。经过同源重组,将其整合到毕赤酵母GS115染色体上,重组位点位于AOX1基因启动子与转录终止子之间。利用Zeocin抗性筛选和PCR检测获得阳性克隆子。将筛选到的阳性克隆子再进行甲醇诱导产酶培养,表达产物经SDS-PAGE电泳分析,相对分子量约为97kD,表达量为0.2-0.3 mg/ml。各重组菌的β-葡萄糖苷酶活测定结果为0.184-0.448 IU/ml。通过酶学性质研究该酶反应最适pH 5.5,最适温度50℃。根据SDS-PAGE电泳和酶活分析,证明目的蛋白已在Pichia pastorisGS115中成功实现表达,但表达量和酶活有待提高。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪言
• 前言
• 1.1 β-葡萄糖苷酶的研究进展
• 1.1.1 β-葡萄糖苷酶的性质研究
• 1.1.2 β-葡萄糖苷酶基因的克隆与表达研究
• 1.2 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统
• 1.2.1 巴斯德毕赤酵母特性
• 1.2.2 表达体系简介
• 1.2.3 蛋白在毕赤酵母中的表达
• 1.2.4 应用前景
• 1.3 本研究的目的与意义
• 1.4 研究内容与技术路线
• 第二章 黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因的cDNA克隆
• 前言
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 工具酶及主要试剂
• 2.1.3 主要实验仪器
• 2.1.4 主要溶液和培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 黑曲霉的诱导培养
• 2.2.2 黑曲霉总RNA的提取
• 2.2.3 RT-PCR获取目的基因
• 2.2.4 克隆载体的构建与转化
• 2.2.5 基因测序分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 总RNA提取
• 2.3.2 RT-PCR结果
• 2.3.2 重组子筛选与检测
• 2.3.3 基因序列测定与分析
• 2.4 讨论
• 2.4.1 样品的处理及RNA提取
• 2.4.2 RT-PCR实验
• 2.4.3 基因结构与功能分析
• 第三章 β-葡萄糖苷酶基因在毕赤酵母中表达
• 前言
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌株和质粒
• 3.1.2 工具酶
• 3.1.3 主要实验仪器
• 3.1.4 培养基和部分溶液配制
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 重组载体pPICZ a-bgl的构建
• 3.2.2 转化毕赤酵母
• 3.2.3 重组酵母的验证
• 3.2.4 表达产物的检测
• 3.2.5 表达的β-葡萄糖苷酶酶活分析
• 3.2.6 重组β-葡萄糖苷酶的酶学性质
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 重组表达载体的构建与验证
• 3.3.2 酵母转化重组子的筛选
• 3.3.3 表达产物的SDS-PAGE分析
• 3.3.4 酶活测定结果
• 3.3.5 重组酵母β-葡萄糖苷酶性质
• 3.4 讨论
• 3.4.1 表达载体与宿主菌的选择
• 3.4.2 关于转化酵母
• 3.4.3 关于诱导表达
• 3.4.4 影响酶活和蛋白质表达的因素讨论
• 第四章 结论与建议
• 4.1 结论
• 4.2 创新点
• 4.3 建议
• 参考文献
• 附录A:缩略词表
• 附录B pGM-T载体图谱
• 附录C pPICZ a表达载体图谱
• 附录D:bgl基因部分测序报告
• 附录E:bgl基因注册GenBank
• 附录F:攻读硕士研究生期间的科研成果
• 致谢