蛋白酶体抑制剂Bortezomib在大鼠胆汁淤积性肝损伤中保护作用机制的研究

论文摘要

目的：梗阻性黄疸（Obstruction Jaundice, OJ）是一类临床上比较常见的外科疾病。由于胆道梗阻,肠肝循环被阻断,胆汁淤积可以引起肝细胞损害,若不及时阻断对肝细胞损伤,会导致肝脏纤维化及胆源性肝硬化的发生,甚至诱发肝功能衰竭,最终导致患者死亡。临床上目前针对胆道梗阻胆汁淤积性肝损伤的治疗还没有特别有效的治疗方法,治疗效果欠佳,原因可能是导致胆汁淤积性肝损伤的具体机制尚不清楚有关。新近的研究表明,胆道梗阻胆汁淤积时NF-κB的激活在肝细胞损伤及肝纤维化过程中扮演重要的角色。因此,如何抑制胆道梗阻胆汁淤积病理过程中NF-κB的激活,很有可能是减轻胆道梗阻胆汁淤积性肝损伤一个重要的治疗靶点。实验拟通过建立大鼠胆道梗阻模型来研究Bortezomib对肝细胞的保护作用机制。方法：健康雄性大鼠Spague-Dawlay（SD）共48只,体重200-250g,实验大鼠按照随机原则分为3组,Ⅰ组（假手术组/SO+NS）1 2只、Ⅱ组（模型组/BDL+NS）12只、Ⅲ组（治疗组/BDL+Bor）12只；另设一组胆总管结扎组12只即为Ⅳ组（生存率组）观察生存率。术前24小时第Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ组用生理盐水2ml,第Ⅲ组用Bortezomib 0.2mg/kg加生理盐水稀释成2ml腹腔注射。术前禁食10小时,自由饮水,氯胺酮注射液150mg/kg腹腔注射麻醉,在无菌条件下取上腹部横切口或者竖切口逐层入腹,Ⅰ组仅仅做胆总管分离,不予结扎,与Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组暴露手术相同时间后关腹；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组距肝门0.5cm处分离胆总管用4-0#丝线双重结扎胆总管后关闭腹腔,术后每只大鼠后颈部皮下注射补液0.9%生理盐水2 ml。术后第4天第Ⅰ、Ⅱ组用生理盐水2ml,第ⅢⅢ组使用Bortezomib 0.2 mg/kg加生理盐水稀释成2 ml腹腔注射,第Ⅳ组正常喂养；术后7天重复同样操作。术后第15天在氯胺酮注射液150 mg/kg腹腔注射麻醉下处死第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组大鼠。拍摄肝脏标本、胆总管扩张时的照片；心脏采血共5ml,离心后的血清一部分测定大鼠血清转氨酶（ALT、AST）、总胆红素（TBIL）和总胆汁酸（TBA）水平；另一部分用ELISA法测定血清IL-6、TGF-p水平。血液标本采集后继续采集肝组织标本,用4%中性甲醛固定肝组织标本,制备石蜡切片,行苏木精-伊红染色（HE）观察肝脏病理改变、马松染色（Masson）观察肝脏胶原蛋白表达水平、免疫组化检测NF-κB在肝组织中表达水平。采用SPSS16.0统计软件进行数据分析。计数资料采用卡方检验,两者相关性分析采用直线相关分析；计量资料使用均数±标准差（x±S）表示,采用t检验,组间比较采用方差分析,方差齐者采用单因素方差分析,方差不齐者采用H检验,p<0.05为差异有统计学意义。结果：术后第15天实验大鼠全部存活,（1）HE染色显示：第Ⅰ组大鼠肝组织标本无明显病理变化；第ⅡI组大鼠肝组织标本可见肝细胞肿胀、水样变性、空泡变性、有少量点状或灶状坏死；炎性细胞浸润,肝小叶组织形态紊乱；第Ⅲ组大鼠肝组织标本病理改变较之Ⅱ组明显减轻,可见少量炎性细胞浸润,仍可见肝细胞肿胀以及少量灶性坏死。（2）血清学显示TBIL （umol/L）、TBA（umol/L）、ALT（U/L）、AST （U/L）水平；第Ⅰ组分别为12.66±3.56,6.99±2.51,30.92±4.21；26.99±9.79；第Ⅱ组分别为142.95+8.18,200.75±17.80,128.61士16.88,811.28±43.49；第Ⅲ组分别为88.70±5.37,132.86±14.03,44.80±7.73,223.59±42.94,（p<0.05）。（3）双抗体两步夹心酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清IL-6、TGF-β水平；第Ⅰ组分别为73.59±3.59,78.32±3.84；第Ⅱ组分别为117.43±3.26,147.10±5.18；第Ⅲ组分别为90.11±3.51,116.69±4.54 p<0.05)。（4）免疫组化实验数据采用积分光密度值（Integrated optical density, IOD）作半定量分析,第Ⅲ组大鼠肝脏标本NF-κB/p65蛋白的表达明显低于第Ⅱ组（p<0.05）。（5）Masson染色：第Ⅰ组大鼠肝脏标本几乎不表达胶原蛋白,第Ⅱ组大鼠肝脏标本大量表达胶原蛋白,第Ⅲ组大鼠肝脏标本表达少量胶原蛋白表达明显低于第Ⅱ组（p<0.05）。（6）生存率观察：生存率组术后第15天大鼠全部存活,术后第28天出现第一只大鼠死亡,之后间断出现大鼠死亡,术后第132天大鼠全部死亡。结论1)Cs性肝损伤时,NF-KB/p65表达增强可上调炎性因子IL-6,并诱导TGF-p和胶原蛋白表达增强,与肝脏纤维化有密切关系。2) Bortezomib对大鼠Cs性肝细胞损伤有一定的保护作用,其机制可能是通过抑制26S蛋白酶体降解I-κB避免NF-κB的活化从而减轻Cs性肝损伤和肝脏纤维化。

论文目录

• 1 蛋白酶体抑制剂Bortezomib在大鼠胆汁淤积性肝损伤中保护作用机制的研究
• 1.1 中文摘要
• 1.2 Abstract
• 1.3 前言
• 1.4 材料与方法
• 1.5 结果
• 1.6 讨论
• 1.7 结论
• 1.8 参考文献
• 1.9 英汉缩略词对照表
• 2 致谢
• 3 胆管病的发病机制研究进展（综述）
• 参考文献